RNA干擾沉默宮頸鱗癌細胞中HIF-1a基因對survivin基因表達的影響

古力米熱·布然江　艾力克木·阿不都玩克　李小文

RNA干擾沉默宮頸鱗癌細胞中HIF-1a基因對survivin基因表達的影響

古力米熱·布然江1艾力克木·阿不都玩克2李小文1

【摘要】目的 研究RNA干擾對宮頸鱗癌SiHa細胞中HIF-1α及survivin的抑制效應。方法 使用不同缺氧時間分別缺氧SiHa細胞，以Westernblot法檢測細胞中HIF-1a蛋白的表達變化，選擇可以引起HIF-1a蛋白表達增加的缺氧培養時間。進行缺氧后用Westernblot法和逆轉錄聚合酶鏈反應檢測HIF-1α及survivin的表達。結果 SiHa細胞HIF-1α的表達在缺氧處理時較常氧培養時增加，在缺氧后24～48小時內明顯升高，60小時略有降低，72～96 h逐漸減少。氯化鈷培養后SiHa細胞的HIF-1a蛋白及survivin蛋白表達增加，并與氯化鈷濃度有關。通過RNA干擾技術抑制HIF-1a基因的干擾后的細胞中HIF-1a及survivin表達同時減少。結論 在SiHa細胞中，HIF-1α基因和survivin表達具有高度的相關性，并且抑制HIF-1α表達可能通過抑制survivin而促進癌細胞的凋亡。

【關鍵詞】宮頸鱗癌；細胞缺氧；缺氧誘導因子1-α亞基；細胞凋亡

作者單位： 1 830011烏魯木齊，新疆醫科大學附屬腫瘤醫院婦科放射治療（二）病區；2 830011烏魯木齊，新疆維吾爾自治區人民醫院

Effect of RNA Interference Silencing HIF-1a Gene in Cervical Squamous Cell on Carcinoma Cells Survivin Gene Expression

Gulimire·Buranjiang1Ailikemu·Abuduwanke2LI Xiaowen1, 1 Tumor Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China, 2 The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830011, China

[Abstract]Objective To explore the inhibition effect of RNA interference to HIF-1 alpha and survivin in cervical squamous carcinoma SiHa cells. Methods Deprivate oxygen to SiHa cells in different time, then detecte the changing of HIF-1a protein by Westernblot and choosing the right time which can increase the expression of HIF-1a. Use Westernblot and RT-PCR to detect the expression of HIF - 1 alpha and survivin. Results The HIF-1a expression in SiHa cells was increased by oxygen deprivation, and rised in 24~48 h, decreased a little in 60 h and much more in 72~96 h. The expression of HIF-1a and survivin is related to the concentration of CoCl2, and was decreased by using RNA interference. Conclusion In SiHa cells, the expression of HIF-1a is highly related to survivin so that suppression of HIF-1a could promote apoptosis of cancer cells.

[Key words]Cervical squamous cell carcinoma, Cell hypoxia, HIF-1a, Cell apoptosis

宮頸癌是常見的惡性腫瘤，治療方式以放化療為主。腫瘤的放射敏感性與腫瘤細胞是否為乏氧細胞、腫瘤組織中乏氧細胞的比例、是否有放射損傷的修復能力等因素有關[1]。本文使用不同缺氧時間分別缺氧SiHa細胞，以Westernblot法檢測細胞中HIF-1a及survivin蛋白的表達，探討不同條件下RNA干擾對兩種蛋白的抑制效應。

1　材料與方法

1.1材料

人宮頸鱗癌SiHa細胞株購自中科院上海細胞所，穩定轉染針對HIF-la的shRNA的干擾細胞由本實驗室構建保存，羊抗兔二抗購自晶美公司，BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜購自Roche公司，化學發光試劑盒均購自Pierce公司，HRP標記的羊抗鼠二抗購自Rockland公司，其余試劑均為分析純。

1.2方法

（1）SiHa細胞培養并使其處于乏氧狀態。（2）WesternBlot檢測HIF-1α基因、survivin基因表達。（3）建議病毒干擾載體，運用脂質體轉染的方法，完成干擾基因的表達。（4）RT-PCR方法檢測HIF-1α、survivin基因干擾效果，進行基因沉默細胞株的建立及鑒定。

表1　缺氧誘導與基因表達強度量效關系［n=3,（x-±s）］

1.3統計學處理

運用SPSS 17.0統計軟件，所得數據以（x-±s）表示，行分組t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

乏氧狀態下SiHa細胞的HIF-1α及survivin蛋白表達也增加，并與乏氧濃度有關，見表1。選擇合適濃度缺氧不同時間，結果顯示，細胞常氧時HIF-1α及survivin表達缺氧后24～48小時內明顯升高，60小時略有降低，72～96小時逐漸減少。

3　討論

作為HIF-1唯一的氧調節亞單位，在乏氧條件下，HIF-1α的表達增強，可以與細胞核內乏氧反應元件相結合，上調超過40個其下游基因的表達，包括血管內皮生長因子、轉化生長因子等，從而使腫瘤的的血管生成增加、腫瘤細胞的侵襲能力增強、對放化療的抗拒性增加[2]。通過抑制其表達可以干擾惡性腫瘤細胞的有絲分裂，影響腫瘤細胞增殖。Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員，是作用最強的凋亡抑制因子，參與腫瘤細胞缺氧誘導調節過程[3]。

本實驗中，HIF-1α表達與缺氧時間有關，但mRNA表達無明顯差異，提示缺氧誘導的HIF-1α的調節可能僅發生在蛋白水平。在SiHa細胞中，HIF-1α基因和survivin表達具有高度的相關性，提示抑制HIF-1α表達可能通過抑制survivin而促進癌細胞的凋亡。

參考文獻

[1]劉少兵，周祖金，陳森，等. 同步放化療治療中晚期宮頸癌[J].腫瘤防治研究，2007，34（3）：204-206.

[2] 景紹武，王雅棣. 缺氧誘導因子-1與腫瘤[J]. 癌變·畸變·突變，2011，23（3）：235-241.

[3] 王婷玉，李俊. 凋亡抑制蛋白的研究進展[J]. 安徽醫藥，2005，9（6）：402-406.

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金面上項目（編號：2012211 A1047）

通訊作者：李小文，E-mail：1538434747@qq.com

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.25.041

【文章編號】1674-9308（2015）25-0060-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R730.2