大蒜素對人宮頸癌HeLa細胞周期和凋亡的影響

劉玲，聶丹，鄒倩，詹平，任黔川，陳建瓊，毛熙光(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000)

大蒜素對人宮頸癌HeLa細胞周期和凋亡的影響

劉玲，聶丹，鄒倩，詹平，任黔川，陳建瓊，毛熙光(瀘州醫學院附屬醫院，四川瀘州646000)

摘要:目的探討大蒜素對人宮頸癌HeLa細胞周期和凋亡的影響。方法將2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL大蒜素分別作用于體外培養的HeLa細胞，24、48、72 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察HeLa細胞形態學變化;采用WST-8法測定HeLa細胞的增殖抑制率;流式細胞術測定HeLa細胞的凋亡率和細胞周期。結果倒置相差顯微鏡下觀察到細胞凋亡的形態學改變。大蒜素干預后HeLa細胞增殖受抑，且呈濃度與時間依賴性(P均＜0.05);隨著大蒜素濃度的增加，細胞凋亡率增加，G1期細胞比例增加。結論大蒜素能阻滯HeLa細胞的周期進展，誘導細胞凋亡。

關鍵詞:宮頸腫瘤;大蒜素; HeLa細胞;細胞周期;細胞凋亡

Influence of Allicin on cell cycle and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells

LIU Ling，NIEdan，ZOU Qian，ZHAN Ping，REN Qian-chuan，CHEN Jian-qiong，MAO Xi-guang(The Affiliated Hospital of Luzhoumedical College，Sichuan 646000，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of allicin on the cell cycle progression and apoptosis of human cervical carcinoma HeLa cells.Methods The HeLa cells cultured in vitro were treated withdifferent concentrations of allicin(2.5，5，10，20，40，80 and 120 μg/mL)for 24 h，48 h and 72 h.Then，themorphologic changes were observed by inverted phase contrastmicroscope.WST-8 was used tomeasure the proliferative inhibition rate of allicin on HeLa cells，and the cell cycle progression and apoptosis rate weredetected by flow cytometry.ResultsThemorphological changes of apoptosis was observed by inverted phase contrastmicroscope.The proliferation of HeLa cells was inhibited after the intervention of Allicin，which was in adose-and time-dependentmanner(all P＜0.05).With the increasing concentration of allicin，the apoptosis rate was increased and the proportion of G0/G1cells was increased significantly.ConclusionAllicin can inhibit the HeLa cell proliferation，whichmay be related to the inducing cell apoptosis and blocking cell cycle progression.

Key words:cervical carcinoma; allicin; HeLa cells; cell cycle; apoptosis

大蒜素是從大蒜的球形鱗莖中提取的揮發性油

狀物具有抗菌、抗病毒、抗真菌及原蟲、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板聚集、降壓、降低膽固醇、提高機體免疫等多種生物學功能［1］。大蒜中含有廣泛的多硫化物，可在細胞內分解產生烯丙基硫醇和烯丙甲基硫化物，修飾含巰基的酶類，從而發揮大蒜素的各種治療作用，能解毒致癌物質，抑制活性氧的產生，調節細胞周期和誘導細胞凋亡，在腫瘤治療中具有化學預防劑的作用［2，3］。2013年1月，我們以人宮頸癌HeLa細胞系為研究對象，用大蒜素對其進行體外干預，探討大蒜素對細胞周期和細胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料大蒜素(純度95%)購自南京澤朗醫藥科技有限公司，以DMEM F-12培養基配制大蒜素工作液，濃度分別為2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL。細胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，CCK-8試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所。人宮頸癌HeLa細胞株購自重慶醫科大學病理生理學教研室(培養體系為DMEM F-12培養液，10%胎牛血清，37℃、5% CO2條件下培養，每天

換液1次，每2～3d傳代1次。取對數生長期細胞用于本實驗)。

1.2細胞增殖抑制率測算接種對數生長期HeLa細胞至96孔培養板，每孔加入100 μL(約5×103個細胞)，培養24 h后，加入各濃度組大蒜素，陰性對照組不加藥物，空白對照組為完全培養基，每組設3個復孔，培養24、48、72 h后，分別在各時間段結束前1 h每孔加入CCK-8原液10 μL，繼續培養1 h后上酶聯免疫檢測儀測定各孔吸光度值(OD值)，計算細胞增殖抑制率。重復實驗3次。細胞增殖抑制率(%)=(1－實驗組OD均值/對照組OD均值)× 100%。終止培養前，倒置相差顯微鏡下觀察各組HeLa細胞的形態學變化。

1.3細胞凋亡率測算接種對數生長期HeLa細胞至6孔培養板，每孔加入2mL(約1×107個細胞)，培養24 h后，加入各濃度大蒜素，并按WST-8法設陰性對照及空白對照各1孔，繼續培養24 h。另一6孔板加入含10 μg/mL大蒜素的培養液，共3孔，分別繼續培養24、48、72 h。如前法設陰性對照及空白對照各1孔。然后用0.25%胰酶消化細胞，2 000 r/min離心5min，PBS漂洗，加入5 μL Annexin V-FTTC混勻，加入5 μL Propidium Lodide混勻;室溫、避光反應5～15min，1 h內以標準程序用流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC(+)/PI(－)細胞判定為凋亡細胞。實驗重復3次。

1.4細胞周期測算細胞的準備同1.3。將制備的單細胞懸液室溫離心，以2% PBS液0.5mL重懸細胞，于冰上操作，100%乙醇1.5mL固定，4℃保存過夜。1 000 r/min離心5min，2% PBS液3mL洗滌，100 μL RNase A 37℃水浴30min，400 μL的PI染色混勻，4℃避光30min。上流式細胞儀檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光。使用CellQuest軟件分析數據。

1.5統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量數據以珋x±s表示，進行單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大蒜素對人宮頸癌HeLa細胞增殖的影響隨著大蒜素濃度和時間的增加，細胞增殖抑制率逐漸升高，呈濃度和時間依賴性(P均＜0.05)。見表1。

表1　不同濃度大蒜素干預人宮頸癌HeLa細胞后不同時點細胞增殖抑制率(%，)

表1　不同濃度大蒜素干預人宮頸癌HeLa細胞后不同時點細胞增殖抑制率(%，)

注:相同時點不同濃度組間兩兩比較，P＜0.05;相同濃度不同時點兩兩比較，P＜0.05。

細胞大蒜素濃度(μg/mL)細胞增殖抑制率24 h　48 h　72 h 2.5　24.42±2.67　28.45±3.32　42.19±2.76 5 26.32±1.74　31.48±1.59　55.34±1.34 10　33.27±1.33　36.67±1.58　57.32±1.80 20　36.17±0.98　41.33±1.40　59.27±1.09 40　38.40±0.96　46.39±1.10　67.11±0.86 80　43.42±1.28　67.45±1.07　73.31±1.06 120　49.44±1.25　70.36±0.68　82.37±1.02

2.2大蒜素對HeLa細胞凋亡的影響隨著大蒜素濃度和時間增加，HeLa細胞凋亡率逐漸升高，呈明顯濃度時間依賴性(P均＜0.05)，見表2、表3。

2.3大蒜素對HeLa細胞周期的影響不同濃度大蒜素(分別為2.5、5、10、20、40、80、120 μg/mL)作用HeLa細胞24 h后，低于10 μg/mL大蒜素對He-La細胞周期阻滯作用不明顯;當大蒜素濃度≥10 μg/mL時，隨著大蒜素濃度的增加，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例降低，差異有統計學意義(P＜0.05);而G2/M期的細胞數目變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。10 μg/mL大蒜素分別干預HeLa細胞24、48、72 h，隨著作用時間的延長，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，差異有統計學意義(P＜0.05); G2/M期細胞比例變化不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表2　不同濃度大蒜素干預24 h對HeLa細胞凋亡及細胞周期的影響(%，)

表2　不同濃度大蒜素干預24 h對HeLa細胞凋亡及細胞周期的影響(%，)

注:與0mg/mL比較，ΔP＜0.05。

大蒜素濃度(μg/mL)　　細胞凋亡率　各期細胞比例G0/G1期　G2/M期　S期0 3.29±0.38　34.20±1.21　21.79±0.85　44.01±1.53 2.5　7.02±0.12Δ　29.30±1.34　28.10±0.47　42.60±1.24 5 10.82±0.34Δ32.60±2.13　25.90±1.25　41.50±1.58 10　14.48±0.28Δ　38.10±1.62Δ8.80±1.05　53.10±1.02Δ20　18.21±0.24Δ　49.20±1.07Δ8.60±1.08　42.20±1.42Δ40　21.97±1.17Δ　56.10±1.62Δ　5.00±0.72　38.90±1.15Δ80　27.95±2.31Δ　59.80±1.20Δ　9.60±1.12　30.60±1.36Δ120　63.06±5.32Δ　66.60±3.25Δ　8.60±1.04　24.80±1.19Δ

表3　10 μg/mL大蒜素干預不同時間對HeLa細胞凋亡及細胞周期的影響(%，)

表3　10 μg/mL大蒜素干預不同時間對HeLa細胞凋亡及細胞周期的影響(%，)

注:不同時間點細胞凋亡率及G0/G1期、S期細胞比例比較，P ＜0.05。

作用時間　　細胞凋亡率　各期細胞比例G0/G1期　G2/M期　S期24 h　9.37±1.39　38.10±1.62　8.80±1.05　53.10±1.02 48 h　45.43±4.37　40.40±2.37　18.20±3.26　41.40±2.64 72 h　61.84±3.74　47.20±4.24　17.60±2.83　35.20±2.35

2.4細胞形態學改變不同濃度大蒜素干預后，HeLa細胞均明顯皺縮，體積縮小，細胞大小較均等，密度降低，間隙增大，細胞漂浮，胞質及核濃縮，細胞內顆粒逐漸增多，顏色加深。隨大蒜素作用濃度增

加及時間延長細胞形態改變逐漸明顯。10 μg/mL大蒜素干預HeLa細胞2 h后，細胞形態即有明顯凋亡表現。而對照組細胞均貼壁生長，狀態良好，細胞伸展，呈梭形或不規則多角形，細胞核較大。

3　討論

大蒜素主要依賴烯丙基和含硫基團在細胞內分解為二硫及三硫化合物，修飾含巰基的酶類，從而抑制腫瘤細胞的惡性增殖［4，5］。張敏等［6］發現大蒜素對人宮頸癌HeLa和Caski細胞有明顯增殖抑制作用，大蒜素對Caski細胞作用更敏感。本實驗結果顯示，大蒜素呈劑量和時間依賴方式抑制人宮頸癌HeLa細胞的增殖，與其他癌細胞系報道一致［6］。本實驗以2.5 μg/mL大蒜素作用HeLa細胞24 h，細胞增殖抑制率即為24%，說明小劑量大蒜素短時間內即可部分抑制HeLa細胞的增殖。此外，本研究還觀察到大蒜素作用后的HeLa細胞體積縮小，多數細胞形態由多角形變成卵圓形或圓形，胞核變小，大蒜素可能通過控制細胞體積來調節細胞增殖。

細胞凋亡常參與多種疾病的發生與發展，尤其與腫瘤密切相關。研究認為，如果可以人為地啟動腫瘤細胞凋亡系統則能達到臨床治療目的。張敏等［7］研究發現大蒜素通過上調死亡受體4、5的表達、提高caspase-3、8的活性以增強TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制人卵巢癌細胞SKOV-3的增殖。李民華等［8］研究顯示，大蒜素通過上調TRAIL表達，進而活化caspase-3、8、9誘導細胞凋亡，從而實現對宮頸癌HeLa和Caski細胞生長的抑制作用。Oommen等［9］研究發現，大蒜素能激活caspase-3、8、9家族，從而促進人宮頸癌HeLa、Siha細胞(宮頸鱗癌細胞)、人大腸癌Sw480細胞凋亡。Xiao等［10］發現，大蒜素可激活NIH 3T3細胞caspase-3誘導其凋亡。本研究發現，大蒜素能促進HeLa細胞的凋亡，隨著大蒜素濃度的增加，作用時間的延長，HeLa細胞的凋亡率逐漸升高。2.5 μg/mL大蒜素即可致(8.54±1.53)%的HeLa細胞凋亡，明顯高于對照組的凋亡率(3.76±2.03)%，表明大蒜素對HeLa細胞的凋亡有較強促進作用。因此，本研究認為大蒜素可能通過激活某些信號傳導途徑，促進宮頸癌細胞凋亡，達到抑制癌細胞無限增殖的目的。

細胞在增殖、分化和凋亡方面的異常均參與了腫瘤的發生和發展，其中細胞周期紊亂是腫瘤發生機制之一。細胞周期由G1期、S期、G2期和M期構成。王霞等［11］研究證實，大蒜素可將黑色素瘤B16細胞阻滯于G0/G1期。張敏等［12］研究證實大蒜素可使人宮頸癌Hela細胞周期阻滯于G2/M期。本研究發現，大蒜素以濃度和時間依賴的方式使宮頸癌HeLa細胞G1期細胞所占比例升高，S期細胞所占比例下降，而對G2/M期細胞無影響，表明大蒜素可通過某些方式抑制細胞周期G0/G1期到S期的轉換，阻滯細胞周期的進展，抑制細胞增殖。

大蒜素對胃癌、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、白血病等多種腫瘤細胞均有明顯抑制作用［12］，與化療藥物合用，能增強抗腫瘤藥物的殺傷作用，并在一定程度減輕化療不良反應［13］。本研究發現大蒜素可阻滯細胞周期的進展，誘導細胞凋亡，抑制人宮頸癌細胞的增殖。

參考文獻:

［1］Jemal A，Bray F，CentermM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2): 69-90.

［2］Ota T，Takeshima N，Tabata T，et al.Treatment of squamous cell carcinoma of the uterine cervix with radiation therapy alone: long term survival，late complications，and incidence of second cancers ［J］.Brit J Cancer，2007，97(8): 1058-1062.

［3］Pabla N，Dong Z.Cisplatin nephrotoxicity:mechanisms and renoprotective strategies［J］.Kidney International，2008，73(9): 994-1007.

［4］Schwarz Y，Kindil L，Shai AB，et al.The active compound of garlic to treat non-small cell lung cancer: in vitro studies［J］.Eur Respir J，2013，42(9): 3111-3168.

［5］Lee CG，Pyo S.Allicin inhibitsmetastasis ofmCF-7 cells by inhi bition of VCAM-1 expression［J］.FASEB J，2013，27(4): 1105-1117.

［6］張敏，奚杰，孫大偉，等.大蒜素對宮頸癌細胞生長的影響及作用機制［J］.中國實用婦科與產科雜志，2011，27(1): 39-41.［7］張敏，高潔凡，王慧蘭，等.大蒜素對TRAIL誘導SKOV-3細胞凋亡影響的作用機制［J］.河北醫藥，2011，33(6):826-827.［8］李民華，王慧蘭，張敏，等.大蒜素上調TRAIL表達誘導宮頸癌細胞凋亡機制研究［J］.中國實用婦科與產科雜志，2011，27(6): 432-436.

［9］Oommen S，Anto R J，Srinivas G，et al.Allicin(from garlic)induces caspasemediated apoptosis in cancer cells［J］.Eur J Pharmacol，2004，485(1-3): 97-103.

［10］Xiaod，Pinto JT，Soh JW，et al.Induction of apoptosis by the garlic-derived compound S-Allylmercaptocysteine(SAMC)is associated withmicrotubuledepoly-merization and c-jun NH2-terminal kinase 1 activation［J］.Cancer Res，2003，63(20): 6825-6837.

［11］王霞，茍萍，孫桂林，等.大蒜生理活性物質對胃癌細胞和黑色素瘤細胞抑制作用的研究［J］.中成藥，2010，32(4): 557-561.

［12］張敏，郭亮.大蒜素對人宮頸癌Hela細胞增殖影響及其作用機制［J］.河北醫藥，2010，32(15): 2010-2011.

［13］梅四衛，朱涵珍.大蒜素的研究進展［J］.中國農學通報，2009，25(9): 97-101.

收稿日期:( 2015-01-18)

通信作者簡介:毛熙光(1965-)，男，教授，碩士，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail:mxg6639@163.com

作者簡介:第一劉玲(1981-)，女，主治醫師，碩士，主要研究方向為婦科腫瘤、生殖內分泌。E-mail: Eye99@163.com

基金項目:瀘州市科技計劃項目(2011-S-36);四川省科技廳項目(2008JY0014-1)。

文章編號:1002-266X(2015)33-0015-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.005