柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測器測定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建輝，歐陽麗，彭新凱，夏立新，李　歡，汪　輝

(1.長沙市食品質量安全監督檢測中心，湖南　長沙　410013；2.湖南澄源檢測有限公司，湖南　長沙　410000)

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柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測器測定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建輝1,2*，歐陽麗1，彭新凱1，夏立新1，李歡1，汪輝1

(1.長沙市食品質量安全監督檢測中心，湖南長沙410013；2.湖南澄源檢測有限公司，湖南長沙410000)

摘要：建立了面粉制品中偶氮甲酰胺(ADA)殘留量的丹磺酰氯柱前衍生結合高效液相色譜-熒光檢測器的分析方法。面粉制品中的ADA經濕熱處理后，轉變成氨基脲(SEM)，加入丹磺酰氯(DNS-Cl)進行衍生。采用Aglient TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對衍生產物進行分離，流動相為乙腈-水(65∶35)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，激發波長330 nm，發射波長530 nm，高效液相色譜-熒光檢測器檢測，外標法定量。偶氮甲酰胺在0.1～50 mg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數(r)大于0.998，檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為0.03 mg/L和0.10 mg/L。在0.1，0.3，1.0 mg/kg 3個加標水平下的平均回收率為78.4%～96.6%，相對標準偏差(RSD,n=6)為7.1%～9.4%。該方法具有簡便、快速、靈敏等特點，可用于面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測。

關鍵詞：柱前衍生；高效液相色譜-熒光檢測器；偶氮甲酰胺；丹磺酰氯

偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)又名偶氮二酰胺，為黃至橘紅色結晶性粉末,具有漂白和氧化雙重作用,是工業中常用的發泡劑。偶氮甲酰胺也作為漂白劑和改良劑在面粉中使用，GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》規定小麥粉中偶氮甲酰胺的最大用量為45 mg/kg[1]。研究表明，偶氮甲酰胺在濕熱條件下分解產生聯二脲(Biurea,HDC)，聯二脲在高溫條件下又能轉變成氨基脲(Semicarbazide,SEM)[2]，然而氨基脲具有致突變和致癌作用。近年來，大量研究表明，由于偶氮甲酰胺全部降解生成聯二脲與氨基脲[3-5]，故在面粉制品中不能檢出。因此，有必要建立面粉制品中偶氮甲酰胺的最終代謝產物氨基脲的檢測方法，并通過氨基脲的含量來評估面粉中偶氮甲酰胺的使用量。

目前，有關偶氮甲酰胺及其代謝物聯二脲和氨基脲的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等[8-11]，其中HPLC法具有簡單、快速等特點，但提取困難、操作繁瑣、響應低、干擾多；LC-MS/MS法靈敏度高、專一性強，但儀器價格昂貴；因此開發一種操作簡單、靈敏度高的檢測方法非常重要。丹磺酰氯作為液相色譜柱前衍生試劑具有衍生操作簡單、衍生物穩定性好、熒光吸收強、靈敏度高、反應范圍寬、基體干擾不明顯等優點[12]，在胺類化合物分析中應用廣泛[13-14]，此衍生方法在面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測方面尚未見報道。本文采用丹磺酰氯與偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進行衍生反應，高效液相色譜-熒光檢測器進行分離測定，對面粉制品中偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進行檢測。該方法簡單、快速、穩定，可進行實際應用。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，配自動進樣器和熒光檢測器(日本島津公司)；CT14D型臺式高速離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)；SK-1型快速混勻器(江蘇金壇醫療儀器廠)；A10型超純水處理器(美國Millipore公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司)；正己烷、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化氫、冰醋酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；偶氮甲酰胺(含量>97.0%，上海沃凱化學試劑有限公司)；丹磺酰氯(含量>98.0%，日本東京化成工業)；實驗用水為超純水。

1.2標準溶液的配制

稱取10 mg(精確至0.001 mg)偶氮甲酰胺，用25 mL 0.5 mol/L 鹽酸于60 ℃水解4 h，冷卻后用 0.5 mol/L氫氧化鈉調至中性,加水定容至100 mL配成100 mg/L的標準儲備液，于4 ℃冷藏保存；使用時用水逐級稀釋成所需濃度的工作液。

1.3樣品的提取與凈化

精確稱取1.0 g樣品于15 mL塑料離心管中，加4 mL 0.5 mol/L鹽酸渦旋混勻，60 ℃水浴水解4 h,冷卻后用0.5 mol/L氫氧化鈉調至近中性，分別加入1 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，定容至10 mL后加1 mL正己烷渦旋混勻。5 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，取1 mL上清液衍生。

1.4樣品衍生

取1 mL待衍生液置于15 mL塑料離心管中，加入1 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液(pH 9.5)與1 mL 3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液，渦旋混勻，避光下50 ℃水浴衍生45 min。5 000 r/min離心3 min，將上清液過0.45 μm有機相濾膜后上液相色譜-熒光檢測器檢測。

1.5色譜條件

色譜柱：Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動相：水-乙腈溶液(35∶65)，進樣量10 μL；激發波長330 nm，發射波長530 nm。

2結果與討論

2.1樣品的提取與凈化

面粉制品中添加的偶氮甲酰胺經過高溫、高濕環境后，將分解為聯二脲和氨基脲，采用純水提取時，只能得到基質中的氨基脲[3]。本實驗參考文獻方法[9，11]，采用4 mL 0.5 mol/L鹽酸于60 ℃水浴4 h對樣品進行水解，該條件下面粉制品中的偶氮甲酰胺和聯二脲全部轉化為氨基脲。為保證檢測靈敏度和檢測結果的可靠性，需去除水解后面粉制品中含有的脂肪和蛋白成分。面粉制品經鹽酸水解后，以0.5 mol/L氫氧化鈉調節溶液至中性，再加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白；然后加入正己烷脫脂，5 000 r/min離心5 min后棄去正己烷層。

2.2流動相的選擇

根據相關文獻研究[15]，考察了乙腈-水和乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉(乙酸調至pH 4.2)分別作為流動相時衍生產物與雜質峰色譜分離的情況。結果顯示，提高流動相中乙腈的比例可以加快分離過程，但乙腈比例過高時，目標峰與雜質峰無法基線分離，干擾檢測。當流動相中乙腈和水的體積比為65∶35時，目標峰與雜質峰的分離度為1.8，保留時間為8.354 min，分析時間較短。當流動相中乙腈和0.01 mol/L乙酸鈉的體積比為65∶35時，目標峰與雜質峰也能得到良好分離，但保留時間變長(10.50 min)。此外，乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉流動相的配制繁瑣，因此本實驗采用乙腈-水(65∶35)作為流動相。

圖1　pH值對偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.1　Effect of reaction pH value on peak area of ADA(50 mg/L)

圖2　衍生反應溫度和時間對偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.2　Effect of derivative reaction temperature and time on peak area of ADA(50 mg/L)

2.3衍生條件的優化

2.3.1衍生溶劑的pH值反應介質的pH值對氨基脲衍生反應的影響很大。實驗考察了0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液的pH值分別為8.5，9.0，9.2，9.5，10.0，10.5，11.0時衍生產物的峰面積，結果見圖1。由圖可知：隨著pH值的逐漸增大，衍生產物丹磺酰-氨基脲產量先增加后減小，在pH值為9.5時，衍生物的生成量最大。因此實驗選取pH 9.5的 0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液作為反應介質。

2.3.2衍生溶劑的濃度根據衍生反應的比例關系及衍生劑需適當過量的原則，在系列15 mL離心管中加入1 mL 50 mg/L標準品后，再加入1 mL濃度為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液進行衍生反應。結果顯示：隨著丹磺酰氯濃度的增大，其衍生物產量增多，當加入3.0 mg/mL丹磺酰氯時，衍生物產量達到穩定值；但丹磺酰氯的濃度大于3.0 mg/mL時，衍生反應溶液會出現渾濁，產生不溶性的黃色物質。為節約成本，實驗選取3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液為衍生溶劑。

2.3.3衍生反應溫度與時間的選擇考察了不同溫度和時間對衍生物產率的影響(見圖2)。結果表明：衍生溫度為50 ℃，時間為 45 min時衍生物的生成量最大。對比考察了室溫避光過夜衍生和50 ℃衍生 45 min的結果，2種衍生條件下衍生物的生成量未見明顯增加。由于溫度過高或衍生時間過長時，均會導致衍生副反應過多，而室溫避光隔夜的衍生時間過長，因此實驗選取50 ℃水浴45 min作為衍生條件。

2.4穩定性考察

取相同濃度的標準溶液和樣品加標溶液，分別放置0，5，10，15，24，36 h后進行測定，待測組分峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為3.3%和4.1%，表明衍生物在36 h內穩定性良好。

2.5線性范圍、檢出限與定量下限

分別吸取一定體積的偶氮甲酰胺標準溶液，配制成質量濃度為0，0.1，0.5，1.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的系列偶氮甲酰胺工作液，取1 mL按照“1.4”方法進行衍生，“1.5”方法進行色譜分析。以質量濃度(X，mg/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標求得線性回歸方程為Y=1 659.8X+3 691.7，相關系數(r)大于0.998。以信噪比S/N≥3及S/N≥10分別確定方法的檢出限為0.03 mg/L，定量下限為0.10 mg/L。

2.6回收率與相對標準偏差

選取不含偶氮甲酰胺的面粉制品作為基質，進行0.1，0.3，1.0 mg/kg 3 個濃度水平的加標回收實驗，同一加標水平平行測定6次，其平均回收率分別為78.4%，85.7%，96.6%，RSD分別為9.4%，7.1%及7.5%。相關色譜圖見圖3。

2.7與其他方法的比較

與相關文獻方法進行比較，本方法的定量下限(LOQ=0.10 mg/L)介于HPLC(LOQ=1.0 mg/kg)[6]和HPLC-MS/MS(LOQ=0.000 5 mg/kg)[11]兩者之間，說明本方法靈敏度高，具有很高的準確性。

2.8實際樣品的檢測

應用本方法對市購10個不同類型面粉制品進行分析。結果顯示，4個樣品中檢出偶氮甲酰胺，其含量為1.06～18.4 mg/kg，該含量小于國家規定的偶氮甲酰胺在面粉中的最大殘留限量。

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Determination of Azodicarbonamide in Flour Products by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector Coupled with Precolumn DerivatizationZHANG Jian-hui1，2*，OUYANG Li1，PENG Xin-kai1，XIA Li-xin1,LI Huan1,WANG Hui1

(1.Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China；2.Hunan

Chengyuan Testing Corporation Limited,Changsha410000,China)

Abstract：A method was developed for the determination of azodicarbonamide(ADA) in flour products using dansyl chloride(DNS-Cl) precolumn derivatization combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detector.ADA in flour products was hydrolyzed by wet heat processing and formed semicarbazide(SEM) finally.SEM was derivatized with DNS-Cl.The derivatization product was separated on an Aglient TC C18column(250 mm× 4.6 mm,5 μm) using acetonitrile-water(65∶35) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The oven temperature was set at 30 ℃，the excitation wavelength was 330 nm and the detection wavelength was 530 nm.Under the optimal conditions,the linear range for ADA was in the range of 0.1-50 mg/L with correlation coefficient(r) higher than 0.998.The limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ) for the method were 0.03 mg/L and 0.10 mg/L,respectively.The spiked recoveries of ADA at three levels of 0.1,0.3,1.0 mg/kg ranged from 78.4%to 96.6%with RSDs of 7.1%-9.4%.With advantages of simplicity,rapidness and sensitivivity,the method was successfully applied in the analysis of ADA in flour products.

Key words：precolumn derivatization；high performance liquid chromatography-fluorescence detector；azodicarbonamide(ADA)；dansyl chloride

中圖分類號：O657.72;TQ314.259

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1430-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.018

通訊作者：*章建輝，碩士，工程師，研究方向：食品與環境分析，Tel:0731-88635360,E-mail:zhangjianhui2012@163.com

基金項目：國家公益性行業科研專項項目(201310130)

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-06-02