五味子多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

黃曉東　路　倩　范紅艷　任　曠

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林　吉林　132013)

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五味子多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

黃曉東路倩范紅艷任曠

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林吉林132013)

〔摘要〕目的探討五味子多糖含藥血清對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29體外增殖的影響及作用機(jī)制。方法采用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29作為研究對(duì)象,MTT法檢測(cè)不同濃度的五味子多糖含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核的改變;流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果五味子多糖含藥血清對(duì)HT29細(xì)胞的增殖有抑制作用而且呈劑量和時(shí)間依賴性。五味子多糖含藥血清作用72 h后,熒光顯微鏡可見(jiàn)凋亡細(xì)胞及凋亡小體;流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡。結(jié)論五味子多糖含藥血清對(duì)HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有抑制作用,其作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕結(jié)直腸癌；五味子多糖；增殖；細(xì)胞凋亡

第一作者：黃曉東(1978-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。

復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的最主要原因。有50%以上的結(jié)直腸癌患者會(huì)在病程中發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，有30%患者肝部為唯一轉(zhuǎn)移部位〔1〕，伴肝轉(zhuǎn)移患者的死亡率占直腸癌總死亡率的60%以上〔2〕。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的術(shù)后5年生存率僅為37%～58%〔3〕。可見(jiàn)，有效控制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生和發(fā)展是治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵。五味子是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，味酸、性甘溫，具有興奮呼吸、調(diào)節(jié)血壓、改善智力、保肝、抗腫瘤、抗氧化與抗衰老等作用。五味子多糖(ASPS)是從五味子干燥成熟果實(shí)中提取的含有五味子總多糖、十幾種氨基酸和十幾種微量元素的混合物，具有抗腫瘤、護(hù)肝、免疫促進(jìn)等多種藥理活性〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)擬觀察ASPS對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖作用的影響并探討其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供；Wistar大鼠，SPF級(jí)，40只，雌雄各半，180～200 g，購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；ASPS純度為91.4 %，由吉林大學(xué)藥學(xué)院提供；Hochest染色試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)；Annexin V FITC/PI試劑盒、碘化丙啶(PI)(美國(guó)Sigma公司)；

1.2方法

1.2.1ASPS含藥血清的制備40只Wistar大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(5 ml/kg)、ASPS(400 mg/kg) 組，ASPS(200 mg/kg) 組，ASPS(100 mg/kg) 組。ASPS灌胃給藥，2次/d，連續(xù)給藥7 d。在末次給藥后2 h，將大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4℃ 3 000 r/min離心5 min，分離淡黃色血清。置于56℃水浴，滅活30 min。 0.22 μm微孔濾膜，過(guò)濾除菌，-20℃保存。

1.2.2噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)ASPS含藥血清對(duì)腫瘤細(xì)胞HT-29增殖的影響含10%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培養(yǎng)基加入HT-29 5000個(gè)/ml，種于96孔板，200 μl/孔，培養(yǎng)24 h。棄上清，分別加入200 μl含10%的ASPS含藥血清，培養(yǎng)72 h。棄去上清，加入200 μl 含0.5 mg/ml MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h。棄上清，加入200 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖床混勻10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度值，重復(fù)3次。

1.2.3ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞1×105個(gè)/ml加入培養(yǎng)瓶中。加入10%的ASPS含藥血清，培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.4熒光顯微鏡觀察ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞1×105個(gè)/ml，加入放置有0.9%NaCl溶液處理過(guò)的無(wú)菌蓋玻片的16孔板中，培養(yǎng)24 h。加入10%的ASPS含藥血清，培養(yǎng)48 h。吸去培養(yǎng)液，加入1.0 ml 3.7%多聚甲醛，固定10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，吸凈液體，加入0.5 ml Hochest33258染色液，染色5 min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞1×105個(gè)/ml置于培養(yǎng)瓶中，加入10%的ASPS含藥血清，培養(yǎng)24 h。取1 ml細(xì)胞懸液，4℃，1 000 r/min離心5 min。PBS洗2次，置于200 μl buffer中，Annexin V FITC/PI避光染色5 min，加入200 μl buffer，樣品進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每組3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均凋亡率。

2結(jié)果

2.1ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞增殖活性的影響與生理鹽水組比較，ASPS 200 mg/kg、400 mg/kg組含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制明顯，OD值分別為0.713±0.060、0.687±0.045(P<0.05，P<0.01)。

2.2ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡觀察，ASPS 400 mg/kg含藥血清作用48 h后的HT-29細(xì)胞死亡數(shù)量明顯增多，出現(xiàn)細(xì)胞變圓、核皺縮等，總數(shù)量比組減少。熒光顯微鏡可見(jiàn)，生理鹽水組表現(xiàn)為活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，ASPS 400 mg/kg組，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃染熒光呈致密的顆粒塊狀。見(jiàn)圖1。

圖1　ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASPS含藥血清對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響 ASPS含藥血清作用24 h后，生理鹽水組的HT-29細(xì)胞多位于左下象限是正常細(xì)胞，凋亡百分率為(4.50±1.18)%，ASPS 200、400 mg/kg組的細(xì)胞分布于右上、下限的比例逐漸遞增，細(xì)胞凋亡百分率為(9.10±1.62)%，(13.90±1.40)%，與生理鹽水組比較差異顯著(P<0.01，P<0.01)。ASPS 100 mg/kg組細(xì)胞凋亡率為(5.22±1.03)%。3討論

植物多糖因其廣譜抗腫瘤能力、低毒且副作用小已經(jīng)成為理想的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤新藥。多糖可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能，不僅能激活巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)、自然殺傷細(xì)胞(NK)、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)等免疫細(xì)胞，還能促進(jìn)細(xì)胞因子生成，調(diào)節(jié)機(jī)體抗體和補(bǔ)體形成，提高機(jī)體抗腫瘤免疫力〔7〕。ASPS可提高機(jī)體的非特異性免疫功能，升高外周血白細(xì)胞數(shù)，對(duì)環(huán)磷酰胺所致的外周白細(xì)胞減少有明顯的保護(hù)作用，具有增強(qiáng)非特異性免疫功能和體液免疫功能的作用，從而促進(jìn)機(jī)體的抗癌功能；還具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用〔8〕。細(xì)胞凋亡(APO)是指生物體內(nèi)在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的自主性死亡過(guò)程，對(duì)腫瘤的發(fā)展有重要的意義〔9〕。本文結(jié)果表明，ASPS對(duì)HT29細(xì)胞增殖有抑制作用,其機(jī)制與ASPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-05-16修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：任曠(1963-)，男，教授，主要從事藥理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2014547)

〔中圖分類號(hào)〕R730.52；R735.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6337-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.008