4-1BBL在口腔鱗癌組織中的表達及臨床意義

王笑朵 韓雪松

（1 沈陽和平永嘉口腔門診部，遼寧 沈陽110000；2 遼寧省武警總隊醫院口腔科，遼寧 沈陽 110034）

4-1BBL在口腔鱗癌組織中的表達及臨床意義

王笑朵1韓雪松2*

（1 沈陽和平永嘉口腔門診部，遼寧 沈陽110000；2 遼寧省武警總隊醫院口腔科，遼寧 沈陽 110034）

目的 分析口腔鱗癌組織中4-1BBL（4-1BB Ligand，即4-1BB配體）的表達水平以及臨床意義。方法 應用PCR、FQ-PCR（實時熒光定量聚合酶鏈反應）以及免疫組化法檢測我院口腔腫瘤科獲取的63份口腔鱗癌組織標本和35份癌旁正?？谇唤M織中4-1BBL的表達水平，對比不同組織中4-1BBL表達的差異，分析4-1BBL表達的臨床意義。結果 口腔鱗癌組織中4-1BBL mRNA和蛋白的表達量顯著高于正常組織，不同分化程度的鱗癌組織4-1BBL表達程度具有顯著差異，高分化癌組織中4-1BBL表達水平最高，低分化組織中4-1BBL表達最少，P＜0.05，差異具有顯著性。結論 口腔鱗癌組織中4-1BBL表達水平顯著升高，且4-1BBL表達與癌組織分化程度具有密切關聯，分化程度越高，4-1BBL表達量越高。

口腔鱗癌；4-1BBL；臨床意義

口腔鱗癌作為口腔癌常見類型，不僅能夠破壞顏面美觀性，而且能夠造成嚴重功能障礙，具有較高的病死率。隨著基因組學的發展，基因對于腫瘤的影響受到了廣泛關注，目前相關研究[1-2]證實共刺激分子4-1BBL具有抗腫瘤活性，對于癌癥的免疫治療效果、預后情況能夠產生重要影響。本文通過分析比較不同組織組織中4-1BBL表達的差異性，旨在分析4-1BBL對于口腔鱗癌診治的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象：選取遼寧省武警總隊醫院2010年4月至2015年6月在手術治療中留取的21份口腔鱗癌組織和19份癌旁正常組織作為實驗檢測標本，口腔鱗癌中女性患者11例，男性患者10例，年齡29～71歲，平均年齡（53.46±4.19）歲，其中高分化者8例，中分化者7例，低分化6例，所有患者在手術治療切取癌組織的同時留取癌旁正常組織，所有患者均在知情同意的基礎上接受治療和參與實驗。病理選擇標準：①經病理檢查證實為口腔鱗癌；②年齡＞18歲；③排除合并其他口腔疾病者；④排除轉移癌、合并全身嚴重基礎疾病者；⑤能夠耐受手術治療，相關標本留存完好。

1.2 實驗材料：口腔鱗癌組織、癌旁正常組織（我院病理科提供）；PCR和FQ-PCR試劑盒、Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒以及人4-1BB/4-1BBL（Invitrogen公司）；CPR 4-1BB引物（上海生工生物公司）；熒光定量分析儀（美國R＆D公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本保存：將所留標本分為2份，其中一份用于RNA提取，保存在液氮之中，另一份用于免疫組化檢測，用多聚甲醛固定、石蠟包埋后在4 ℃下保存。

1.3.2 檢測方法：通過Trizol對口腔鱗癌組織和正常組織進行總RNA提取之后，添加Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄獲得總DNA，采取PCR、FQ-PCR電泳檢測4-1BBL的表達水平，FQ-PCR反應體系為10 μL，在添加體系中加cDNA（1 μL）之后，參照試劑盒說明書所列步驟進行檢測，其反應條件為：95 ℃下進行5 min→94 ℃下進行30 s→58 ℃下進行30 s→72 ℃下進行30 s，共完成40個循環。在本實驗中所涉及的4-1BBL和β-actin內參照均采取FQPCR擴增處理，組間表達差異的計算公式為：2－△Ct（△Ct）=Ct4-1BBLCtβ-actin），得到2－△Ct（△Ct）統一進行分析。免疫組化結果根據陽性百分數（0～4分，分數越高，陽性細胞越多）和染色強度（0～3分，分數越高，染色強度越高）進行計分，總分為0～1者為陰性，2～3為弱陽性，4～5為陽性，6～7為強陽性，其中不低于3分者均歸于4-1BBL表達陽性范圍。

1.4 統計學處理：數據分析用SPSS16.0統計學軟件，計量資料用t檢驗分析，計數資料用卡方檢驗分析，P＜0.05，差異具有顯著性。

2 結 果

經過檢測分析后，4-1BBL在正常組織和鱗癌組織中均可見陽性表達，但是其在鱗癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，利用FQPCR進行定量分析，將正常組織中4-1BBL的表達量作為標準，經過計算發現鱗癌組織中表達量約為其的2.20倍，進一步對不同分化程度的鱗癌細胞進行比較，結果發現低分化者的4-1BBL表達量最低，將其作為標準，中分化者約為低分化的1.52倍，高分化者約為低分化者的2.33倍，經過統計學分析，P＜0.05，差異具有顯著性。免疫組化結果顯示，正常組織中共有染色結果11例為陽性，陽性率為31.42%，鱗癌組織共有48例為陽性，陽性率為76.19%，其中36例高分化者有29例為陽性，陽性率為80.56%，16例中分化者有9例為陽性，陽性率為56.25%，13例低分化者有3例為陽性，陽性率為23.08%，經過統計學分析，P＜0.05，差異具有顯著性。

3 討 論

4-1BBL作為腫瘤壞死因子超家族的一員[3]，能夠通過配體-受體的方式進行信號傳導，其能夠維持T細胞活性，目前相關研究證實具有延長免疫應答、增強抗腫瘤效果的作用[4-6]。4-1BBL能夠通過調節細胞毒性T細胞增殖參與腫瘤，目前相關研究發現4-1BBL在多種腫瘤中均有所表達，并且其能夠通過調節T細胞等細胞免疫因子活性而參與抗腫瘤效應發生過程。目前有研究發現，在腫瘤組織中4-1BBL表達水平顯著升高，其能夠增加細胞毒性，產生抗腫瘤治療的作用，而在在人口腔鱗癌組織中，4-1BBL表達水平顯著升高，其能夠提高宿主抑制腫瘤進一步增殖，因此，對4-1BBL腫瘤的發生發展具有重要作用。隨著基因組學的發展，4-1BBL在腫瘤診治中意義的研究也越來越多[7]，但是針對口腔鱗癌與4-1BBL相關性的研究則是鳳毛麟角。本實驗結果顯示4-1BBL在正常組織和口腔鱗癌組織中均可表達，其中鱗癌組織的表達水平顯著高于正常組織，而對于不同分化程度的鱗癌組織進行分析顯示，分化程度越高，4-1BBL的表達水平越高，表明4-1BBL表達量與癌組織分化程度具有顯著相關性。綜上所述，4-1BBL在口腔鱗癌組呈高表達，其表達水平與分化程度顯著相關，有望成為判斷口腔鱗癌分化程度的參考指標。

[1] 姜文國,張樹平,董秀紅,等.4-1 BBL在淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義[J].實用癌癥雜志,2014,29(3):249-251.

[2] Kuang Y,Zhang L,Weng X,et al.Combination Immunotherapy with 4-1BBL and CTLA-4 Blockade for the Treatment of Prostate Cancer [J].Clin Develop Immunol,2012,2012,27(2):158-163.

[3] Jianhui M,Bo-Ram B,Jiawei L,et al.The TNF family member 4-1BBL sustains inflammation by interacting with TLR signaling components during late-phase activation[J].Sci Signaling,2013,6 (295):1749.

[4] 孫順濤,楊宏宇,羅娟,等.4-1BBL在人口腔鱗癌PBL-SCID鼠嵌合模型腫瘤免疫中的作用[J].中國口腔頜面外科雜志,2012,10 (5):354-358.

[5] 黃敬東,孟玉生,林玉婷,等.4-1BBL在口腔鱗癌中的表達及臨床意義[J].口腔醫學研究,2015,31(6):609-612.

[6] Bo Ram Bang ?,Sang Jick Kim ?,Yagita H,et al.Inhibition of 4-1BBL-regulated TLR response in macrophages ameliorates endotoxin-induced sepsis in mice.[J].Eur J Immunol,2015,45(3): 886-892.

[7] 匡幼林,翁小東,劉修恒,等.重組腺病毒介導前列腺特異性膜抗原基因和4-1BBL基因修飾的樹突狀細胞疫苗體外誘導抗腫瘤免疫作用[J].中華實驗外科雜志,2012,29(12):2376-2380.

*通訊作者：E-mail:yjckwxd@126.com