蜂膠醇提物通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡*

李嚴嚴，　徐曉燕，　張家君，　方永奇，　田　華，　焦　鵬，　桑　慧, ，　秦樹存△，　姚樹桐, △

(泰山醫學院 1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,2藥學院, 3附屬醫院， 4基礎醫學院，山東 泰安 271000)

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蜂膠醇提物通過抑制caspase-12減輕氧化低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞凋亡*

李嚴嚴1▲，徐曉燕2▲，張家君3，方永奇4，田華1，焦鵬1，桑慧1, 4，秦樹存1△，姚樹桐1, 4△

(泰山醫學院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,2藥學院,3附屬醫院，4基礎醫學院，山東 泰安 271000)

[摘要]目的： 研究蜂膠醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)對氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導的巨噬細胞凋亡的抑制作用，并探討可能的分子機制。方法: 體外培養RAW264.7巨噬細胞，給予EEP(7.5、15和30 mg/L)、4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA；5 mmol/L)或二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI；5 μmol/L)預處理1 h，再加入ox-LDL(100 mg/L)或衣霉素(tunicamycin，TM；4 mg/L)繼續培養24 h。分別采用MTT法和Annexin V-FITC雙染法檢測細胞活力和凋亡情況；試劑盒測定細胞內超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的水平。采用免疫印跡技術檢測內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑關鍵蛋白caspase-12的表達變化。結果: 與ERS抑制劑PBA相似，EEP呈劑量依賴性減輕ox-LDL所致的巨噬細胞損傷，表現為細胞活力增加(P<0.01)，凋亡率降低(P<0.05)，且可抑制ERS誘導劑TM所引起的巨噬細胞活力下降和凋亡(P<0.05)；與氧化應激抑制劑DPI相似，EEP可抑制ox-LDL誘導的氧化應激反應，表現為ROS和MDA生成減少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)；EEP顯著抑制ox-LDL和TM所誘導的caspase-12活化(P<0.05)；與ox-LDL組比較，PBA和DPI預處理組caspase-12活性也受到明顯抑制(P<0.01)。結論: EEP可減輕 ox-LDL 所誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡，其機制可能與抑制氧化應激和caspase-12活化有關。

[關鍵詞]蜂膠醇取物； 半胱天冬酶12； 氧化低密度脂蛋白； 巨噬細胞； 細胞凋亡

巨噬細胞凋亡是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)斑塊的重要病理學特征和造成斑塊不穩定的決定性因素，進而導致急性心血管事件如急性心肌梗死和心源性猝死的發生[1]。因此，減輕巨噬細胞凋亡被認為是增強AS斑塊穩定性、降低急性血管事件發生率的有效途徑[2]。蜂膠是蜜蜂采集植物幼芽分泌物、樹脂等并混入其上鄂腺分泌物混合加工而成的一種膠狀物，因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調節血糖和機體免疫功能等藥理作用而廣泛應用于傳統醫學[3]。研究表明富含黃酮類化合物的蜂膠醇取物(ethanol extract of propolis，EEP)可抑制巨噬細胞介導的炎癥反應[4]。本室既往研究證實，EEP促進膽固醇逆向轉運、抑制AS病變發展[5-6]，且新近研究表明EEP可通過抑制凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1，LOX-1)介導的氧化應激減輕氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)誘導的內皮細胞損傷[7]。然而EEP是否可減輕ox-LDL所誘導的巨噬細胞凋亡？其機制是否通過抑制caspase-12介導的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑實現？上述問題的解決將為深入認識蜂膠的抗AS作用機制提供新的思路。本工作分別在ox-LDL和ERS誘導劑衣霉素(tunicamycin，TM)誘導的RAW264.7巨噬細胞損傷模型上研究EEP對細胞凋亡和caspase-12活化的影響，探討其對巨噬細胞的保護作用及機制。

材料和方法

1試劑

2’, 7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCHF-DA)購自Molecular Probes；抗β-actin抗體、TM、4-苯丁酸(4-phenylbuty-ric acid，PBA)和二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodo-nium，DPI)購自Sigma；DMEM高糖培養基和RIPA裂解液分別購自Gibco和Solarbio；四甲基偶氮唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT]和 Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒分別購自Genview和南京凱基生物科技公司；兔抗caspase-12多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG分別為Abcam和北京中杉金橋公司產品；增強化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和二氟化樹脂(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜分別為Pierce和Millpore產品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純產品。

2方法

2.1EEP的制備和總黃酮測定采集新鮮泰山松柏蜂膠，烘干、粉碎，按本室既往報道的方法[7]制備EEP。取100克蜂膠溶于1升95%乙醇中，40 ℃超聲處理3 h。然后將上清液用濾紙過濾，收集殘渣，用95%乙醇再提取2次。合并上清液，50 ℃條件下經減壓旋轉蒸發器蒸發。然后在烘箱中干燥，-20 ℃保存。按照國家標準分光光度比色法(GB/T 20574-2006)測定EEP總黃酮含量，結果為(213.46±2.93)mg蘆丁當量/g。使用前將EEP溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，并用細胞培養基稀釋成適當濃度。

2.2ox-LDL的制備按照本室既往報道的方法[8]制備ox-LDL，即采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿LDL，并與10 μmol/L CuSO437 ℃孵育18 h。測定硫代巴比妥酸反應物質 MDA 濃度>30 μmol/g，且瓊脂糖凝膠電泳顯示ox-LDL電泳遷移率增快，為LDL的2.0～2.5倍。

2.3細胞培養與實驗分組鼠源RAW264.7巨噬細胞由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫提供，用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)于5% CO2培養箱中37 ℃培養。隨機分為：(1)正常對照(control)組：培養液中常規培養；(2)ox-LDL組：培養液中加入100 mg/L ox-LDL；(3)EEP預處理組：培養液中先加入EEP(7.5、15和30 mg/L)預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(4)ERS抑制劑PBA預處理組：培養液中先加入5 mmol/L PBA預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL；(5)氧化應激抑制劑DPI預處理組：培養液中先加入5 μmol/L DPI預處理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。另外培養RAW264.7巨噬細胞，先給予30 mg/L EEP預處理1 h，然后與ERS誘導劑TM(4 mg/L)共孵育24 h。除EEP預處理組和TM組外，其它各組均加入0.1%的DMSO，培養 24 h 收集細胞。

2.4MTT法檢測細胞活力將細胞接種于96孔培養板，經處理后每孔加入0.5 g/L的MTT，避光37 ℃培養4 h，棄培養基，每孔加入150 μL DMSO，置水平搖床振蕩10 min，用多功能酶標儀(Tecan)在490 nm處測定吸光度(A)。以正常對照組細胞活力為100%，其余各組細胞活力以其A值占正常對照組A值的百分比表示。

2.5流式細胞術檢測細胞凋亡用Annexin V-FITC/PI雙染色法分析細胞凋亡情況。細胞經處理后，收集并重懸于500 μL上樣緩沖液，與5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫避光孵育15 min。細胞凋亡率由流式細胞儀(Becton-Dickinson)分析測定。總細胞凋亡率(%)=早期凋亡率(Annexin+/PI-)+晚期凋亡率(Annexin+/PI+)。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的測定將細胞接種于96孔板，經處理后，裝載探針，使DCHF-DA終濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育30 min后，無血清培養液洗細胞3次。多功能酶標儀檢測，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。以對照組ROS水平為100%，其它各組ROS水平以其熒光強度占對照組熒光強度的百分比表示。

2.7SOD活性和MDA含量的測定細胞經處理后，收集并重懸于0.5 mL裂解緩沖液中充分裂解，1 500 r/min離心10 min，取上清液檢測SOD活性和MDA含量，分別用×103U/g protein和μmol/g protein表示，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

2.8免疫印跡分析按本室既往報道的方法[9]提取細胞總蛋白，等量的各組總蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至PVDF膜上，經封閉、洗脫后與caspase-12多克隆抗體(1∶1 000)和β-actin(1∶6 000)單克隆抗體室溫孵育4 h，洗膜后與辣根過氧化物酶標記的相應 II 抗室溫孵育1 h。抗原-抗體復合物用ECL法顯示，應用化學發光成像儀(上海歐翔科學儀器有限公司)進行圖像采集。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics)分析蛋白條帶積分吸光度(IA)值，以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白相對水平。

3統計學處理

結果用平均值±標準差(mean±SD)來表示。應用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1EEP抑制ox-LDL誘導的RAW264.7細胞活力降低

MTT結果顯示，以100 mg/L ox-LDL處理24 h，細胞活力降低為正常對照組的55.3%(P<0.01)，而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導的細胞毒性，呈劑量依賴性(P<0.01)，且其對細胞的保護作用與ERS抑制劑PBA相似，見圖1。

Figure 1.EEP inhibited ox-LDL-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L) or PBA (5 mmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖1蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導的RAW264.7巨噬細胞活力降低

2EEP抑制TM誘導的RAW264.7細胞活力降低

ERS誘導劑TM明顯造成巨噬細胞損傷，其細胞活力較正常對照組降低38.3%(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預處理后，細胞活力較TM組明顯升高(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.EEP inhibited TM-induced decrease in viability of RAW264.7 cells. The cells were pretreated with EEP (30 mg/L) for 1 h and then treated to TM (4 mg/L) for 24 h. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖2蜂膠醇提物抑制TM所誘導的RAW264.7巨噬細胞活力降低

3EEP抑制ox-LDL誘導的RAW264.7細胞凋亡

以100 mg/L ox-LDL處理24 h，細胞凋亡率是正常對照組的3.37倍(P<0.01)，而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導的細胞凋亡，以30 mg/L EEP預處理組最為明顯(P<0.05)，且其對細胞凋亡的抑制作用與ERS抑制劑PBA相似，見圖3。

4EEP抑制TM誘導的RAW264.7細胞凋亡

與正常對照組比較，ERS誘導劑TM處理組細胞凋亡率顯著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預處理后，細胞凋亡率較TM組明顯降低(P<0.05)，見圖4。

5EEP抑制ox-LDL誘導的caspase-12活化

采用可同時識別caspase-12 酶原(procaspase-12)和剪切活化形式caspase-12(cleavedcaspase-12)的特異性抗體，進行免疫印跡檢測，以經β-actin校準后的cleaved caspase-12條帶IA值表示caspase-12活化的相對水平。結果顯示ox-LDL處理組cleaved caspase-12水平較正常對照組顯著增加(P<0.01)；而EEP則明顯減輕ox-LDL所誘導的caspase-12活化(P<0.05)，且其作用與ERS抑制劑PBA和氧化應激抑制劑DPI相似，見圖5。

Figure 3.EEP inhibited ox-LDL-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 1. Cell apoptosis was detected by flow cytometry and the total apoptotic cells (early and late-stage apoptosis) were represented by the right side of the panel (Annexin V staining alone or together with PI). Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsox-LDL group.

圖3蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡

Figure 4.EEP inhibited TM-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cells were treated as described in Figure 2, and the cell apoptosis was detected by flow cytometry. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖4蜂膠醇提物抑制TM所誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡

Figure 5.EEP inhibited ox-LDL-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), PBA (5 mmol/L)or DPI (5 μmol/L) for 1 h and then incubated with ox-LDL (100 mg/L) for 24 h. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

圖5蜂膠醇提物抑制ox-LDL所誘導的caspase-12活化

6EEP抑制TM誘導的caspase-12活化

TM處理組cleaved caspase-12水平較正常對照組顯著增加(P<0.01)；而以30 mg/L EEP預處理后，則明顯抑制TM所誘導的caspase-12活化(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.EEP inhibited TM-induced activation of caspase-12. The RAW264.7 cells were treated as described in Figure 2, and the protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTM group.

圖6蜂膠醇提物抑制TM所誘導的caspase-12活化

7EEP抑制ox-LDL誘導的氧化應激反應

如表1所示，與正常對照組比較，ox-LDL處理組ROS和MDA水平顯著增加(P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.01)；而與氧化應激抑制劑DPI相似，以30 mg/L EEP預處理則顯著抑制ox-LDL所誘導的氧化應激反應，表現為ROS和MDA生成減少(P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05)。

表1　蜂膠醇提物對ox-LDL所致氧化應激反應的影響

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsox-LDL group.

討論

AS是一個復雜的多細胞參與的慢性炎癥性病理過程，其中巨噬細胞與AS進展尤其與晚期粥樣斑塊的破裂密切相關。巨噬細胞凋亡不僅直接導致凋亡的平滑肌細胞和巨噬細胞不能被有效吞噬，促進脂質核心的形成及增大，而且富含游離膽固醇的凋亡巨噬細胞通過釋放基質降解蛋白酶損傷纖維帽，并產生白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α等炎癥因子，引起繼發性炎癥反應和壞死，從而促進斑塊不穩定[1]。研究表明，EEP可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所誘導的巨噬細胞中一氧化氮(nitric oxide，NO)、IL-1β和IL-6等炎癥因子的生成與釋放[4, 10]，并可減輕ox-LDL誘導的內皮細胞損傷[7]。本實驗結果顯示，給予ox-LDL處理RAW264.7巨噬細胞24 h，細胞活力降低，凋亡率顯著增加，而EEP則明顯減輕ox-LDL所引起的巨噬細胞損傷，表現為細胞活力增加，凋亡率降低，且呈濃度依賴性，表明EEP對ox-LDL所誘導的巨噬細胞損傷具有保護作用。

目前已知細胞凋亡調控機制除死亡受體途徑和線粒體途徑外，越來越多證據表明內質網也是損傷感知或凋亡信號整合的主要位點，因而提出了內質網凋亡途徑。內質網是調控細胞內蛋白合成、折疊和鈣穩態的重要細胞器，其對環境變化十分敏感，氧化應激、鈣穩態失衡、膽固醇超負荷等理化改變均可導致內質網功能紊亂，出現以未折疊/錯誤折疊蛋白聚集和鈣穩態失衡為主要特征的ERS反應。一定程度ERS通過暫時性抑制蛋白合成、激活內質網相關蛋白降解途徑和上調糖調節蛋白78(glucose-regulated proteins 78，GRP78)、GRP94等分子伴侶調控內質網功能，維持細胞生存。但是過強或長時間ERS則可觸發細胞凋亡，導致不可逆損傷，其中caspase-12是介導ERS相關凋亡途徑的重要分子之一[11]。在靜息狀態下，caspase-12以酶原形式存在于內質網膜胞漿側，而在ERS時被特異激活，通過激活caspase-9和caspase-3而誘導細胞凋亡[12]。來自人臍靜脈內皮細胞的研究表明，ox-LDL通過激活caspase-12誘導細胞凋亡[13]。我們前期工作證實ERS-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)信號途徑介導ox-LDL誘導的巨噬細胞凋亡，而載脂蛋白A1模擬肽D4F可通過抑制該信號途徑減輕ox-LDL對巨噬細胞凋亡的誘導作用[8, 14]。本實驗結果顯示，EEP對ox-LDL所誘導的巨噬細胞損傷的保護作用與ERS抑制劑PBA相似，而且可減輕ERS誘導劑TM所誘導的細胞活力降低和凋亡率增加。另外，與PBA相似，EEP不僅可抑制ox-LDL所誘導的caspase-12活化而且可減輕TM所誘導的caspase-12活化，表明EEP可通過抑制caspase-12活化減輕ox-LDL所誘導的巨噬細胞凋亡。

氧化應激是引起ERS反應的重要因素之一[15]。研究表明ox-LDL主要氧化脂質成分7-酮膽甾醇(7-ketocholesterol，7-KC)可通過氧化應激觸發人動脈平滑肌細胞ERS的發生[16]。本實驗結果顯示，氧化應激抑制劑DPI可抑制ox-LDL所誘導的caspase-12活化，進一步證實ox-LDL通過氧化應激反應激活caspase-12介導的ERS凋亡信號途徑。我們既往研究證實，EEP可通過抑制LOX-1介導的氧化應激減輕ox-LDL誘導的內皮細胞損傷[7]。本實驗結果顯示，與DPI相似，EEP可抑制ox-LDL所誘導的ROS和MDA生成，上調SOD活性，提示EEP對caspase-12介導的ERS凋亡途徑的抑制作用與減輕氧化應激有關。

綜上所述，本研究發現EEP可減輕 ox-LDL 所誘導的RAW264.7巨噬細胞凋亡，其機制可能與抑制氧化應激和caspase-12活化有關。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

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《中國病理生理雜志》編輯部

2015年12月15日

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81260025； No. 30800467)

Ethanol extract of propolis protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by inhibiting caspase-12LI Yan-yan1, XU Xiao-yan2, ZHANG Jia-jun3, FANG Yong-qi4, TIAN Hua1, JIAO Peng1, SANG Hui1, 4, QIN Shu-cun1, YAO Shu-tong1, 4

(1InstituteofAtherosclerosis,KeyLaboratoryofAtherosclerosisinUniversitiesofShandong,2CollegeofPharmacy,3AffiliatedHospital,4CollegeofBasicMedicalSciences,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China.E-mail:shucunqin@hotmail.com;yst228@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the inhibitory effect of ethanol extract of propolis (EEP) on oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced macrophage apoptosis and the underlying molecular mechanisms. METHODS: RAW264.7 macrophages were pretreated with EEP (7.5, 15 and 30 mg/L), 4-phenylbutyric acid (PBA, 5 mmol/L) or diphenyleneiodonium (DPI, 5 μmol/L) for 1 h and then treated with ox-LDL (100 mg/L) or tunicamycin (TM, 4 mg/L) for 24 h. The cell viability and apoptosis were determined by MTT assay and Annexin V-FITC apoptosis detection kit, respectively. The activity of superoxide dismutase (SOD), and the levels of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA) in the cells were measured. The protein levels of caspase-12, a proapoptotic molecule under endoplasmic reticulum stress (ERS), were examined by Western blot analysis. RESULTS: Like PBA (an ERS inhibitor), EEP protected RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced injury in a dose-dependent manner, as assessed by the increased cell viability and the decreased apoptotic rate. The decrease in cell viability and increase in apoptotic rate induced by TM, an ERS inducer, were also attenuated by EEP. Moreover, EEP suppressed ox-LDL-induced oxidative stress as revealed by the decreased generation of ROS and MDA as well as elevated SOD activity, which were similar to DPI, an oxidative stress inhibitor. Furthermore, EEP significantly suppressed ox-LDL- or TM-induced activation of caspase-12. Similar results were observed in the cells pretreated with PBA or DPI and then treated with ox-LDL. CONCLUSION: EEP may protect RAW264.7 macrophages from ox-LDL-induced apoptosis and the mechanism is at least partially involved in the ability of EEP to suppress oxidative stress and subsequent activation of caspase-12.

[KEY WORDS]Ethanol extract of propolis; Caspase-12; Oxidized low-density lipoprotein; Macrophages; Apoptosis

通訊作者△Tel: 0791-86300545; E-mail: wuyanqing01@sina.com.cn

[收稿日期]2015- 03- 18[修回日期] 2015- 10- 27

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2209- 07

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.015

[中圖分類號]R285.5； R363.2

[文獻標志碼]A