核因子E2相關性因子2、血紅加氧酶-1蛋白在6-羥基多巴胺誘導帕金森病模型大鼠腦黑質的動態(tài)表達

孫玉芝 雒曉東 趙貝貝 吳壽海 崔曉峰

(廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

核因子E2相關性因子2、血紅加氧酶-1蛋白在6-羥基多巴胺誘導帕金森病模型大鼠腦黑質的動態(tài)表達

孫玉芝 雒曉東 趙貝貝1吳壽海 崔曉峰2

(廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)

目的觀察帕金森病(PD)模型大鼠腦黑質組織核因子E2相關性因子2(Nrf2)、血紅加氧酶1(HO-1)蛋白的表達。方法 雄性SD大鼠，隨機分為假手術組和模型組，每組按時間分為術后6、24、48 h、1、2、4、8 w 7個亞組。采用6-羥基多巴胺(6-OHDA)左側紋狀體兩點注射法建立PD大鼠模型，假手術組注射0.02%抗壞血酸溶液。Western印跡法檢測術后各個時間點Nrf2核蛋白、HO-1蛋白動態(tài)表達。結果 假手術組術后各時間點Nrf2核蛋白、HO-1蛋白低表達，各個時間點相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組術后各時間點相比，6 h組Nrf2核蛋白表達升高，24 h組HO-1蛋白表達升高，Nrf2核蛋白與HO-1蛋白于均術后1 w達高峰，2、4、8 w有所回落，與假手術組相應時間點比較仍表達較高(P<0.01)。結論 6-OHDA造模后可以激活Nrf2核蛋白，進而上調下游靶基因HO-1蛋白的表達，體內內源性抗氧化系統(tǒng)被激活。

帕金森病；核因子E2相關性因子2；血紅加氧酶1

氧化應激在帕金森病(PD)發(fā)病過程中具有重要地位。已有研究表明6-羥基多巴胺(6-OHDA)立體定向注射大鼠腦內黑質區(qū)，黑質組織中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶含量降低，丙二醛及活性氧含量升高，提示氧化應激損傷〔1〕。核因子E2相關性因子2(Nrf2)在細胞抵御內源性、外源性氧化應激機制中占有重要地位。正常生理狀態(tài)下，Nrf2在胞質中與抑制因子Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)結合，在氧化應激作用下，Nrf2與Keap1解離，轉入細胞核中，與抗氧化反應元件(ARE)結合，調節(jié)其下游抗氧化基因血紅加氧酶1(HO-1)表達，保護組織細胞免受氧化應激損傷。那么，在6-OHDA引起氧化應激狀態(tài)下，大鼠中腦黑質區(qū)內Nrf2蛋白是否能夠被激活？其下游靶基因HO-1是否能夠被激活？本研究采用神經毒性物質6-OHDA立體定向兩點注射左側紋狀體建立PD大鼠模型，動態(tài)觀察PD大鼠中腦黑質Nrf2核蛋白、HO-1蛋白動態(tài)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、動物及試劑 TL-251603型大鼠腦立體定位儀(美國，STOELTING)，SDS-PAGE垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)，核酸蛋白質分析儀(美國Beckman公司)，蛋白質濃縮儀(德國Eppendorf公司)，凝膠掃描系統(tǒng)DF-23B(英國UVP公司)。SPF級別SD雄性大鼠133只，體重220～240 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0094。6-OHDA(Sigma公司)，阿撲嗎啡(APO，Sigma公司)，抗壞血酸(Sigma公司)，兔抗大鼠Nrf2抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠HO-1抗體(Enzolife公司)，細胞核蛋白抽提試劑盒(碧云天公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑配制 6-OHDA溶液：5 mg 6-OHDA溶解于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水1 ml中，質量溶度為5 g/L，分裝后，避光保存-20℃冰箱。0.05%APO溶液：5 mg APO溶于生理鹽水10 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 動物分組 雄性SD大鼠133只常規(guī)飼養(yǎng)1 w，隨機分為假手術組和模型組，然后按照術后6、24、48 h、1、2、4、8 w分為7個亞組，模型組各時間點11只和假手術組各時間點8只。

1.2.3 PD模型制備 大鼠造模前經APO(0.5 mg/kg)誘導確定無異常旋轉行為后采用左側紋狀體兩點注射6-OHDA制備PD模型，10%水合氯醛(0.35 ml/kg)大鼠腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜，確定左側紋狀體兩點坐標，坐標1：前囟前1.2 mm，矢狀縫左側2.2 mm，硬膜下4.0～6.0 mm；坐標2：前囟后1.0 mm，矢狀縫左側4.4 mm，硬膜下4.5～6.5 mm，三棱針垂直鉆透顱骨，微量進樣器吸取6-OHDA溶液3 μl，分別緩慢進針達6.0 mm，6.5 mm處，在4.0～6.0 mm，4.5～6.5 mm之間以1 μl/min速度注射，注射完畢后留針15 min，以1.0 mm/min速度緩慢退針，縫合皮膚，術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素防止感染。假手術組注射等量0.02%抗環(huán)血酸生理鹽水溶液，余步驟相同。

1.2.4 模型成功標準 相應時間點取材前進行APO誘發(fā)旋轉行為學檢測。受試大鼠頸背部皮下注射APO(0.5 mg/kg)誘發(fā)其出現(xiàn)旋轉行為，記錄開始旋轉后30 min內旋轉圈數，計算旋轉速度，并觀察其行為表現(xiàn)。模型組術后6、24、48 h時間點大鼠經APO誘發(fā)右側旋轉速度≥4 r/min，1、2、4、8 w大鼠右側旋轉速度≥7 r/min判定造模成功。

1.2.5 標本采集 術后相應時間點取材，6-OHDA各時間點造模成功和假手術組分別抓取6只大鼠以10%水合氯醛麻醉，快速開顱取出腦組織，于冰盤上迅速分離左側中腦黑質組織，-80℃冰箱保存待測。

1.2.6 Western印跡檢測Nrf2細胞核蛋白、HO-1蛋白表達 左側中腦黑質組織，冰上勻漿，分別提取總蛋白，細胞核蛋白并測定蛋白含量。將蛋白樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量蛋白分離，專至PVDF膜上，5%脫脂奶粉(TBST配制)溶液室溫封閉1.5 h，再分別與兔抗大鼠Nrf2抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠HO-1抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST溶液洗3次，后分別在二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，最后加入發(fā)光劑，顯影，曝光。膠片掃描后，使用ipwin32軟件分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參蛋白(GAPDH,Lamin)條帶灰度值比值作為該蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行方差分析及非參數檢驗。

2 結 果

假手術組Nrf2核蛋白，HO-1蛋白呈低表達，各個時間點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。6-OHDA造模后各個時間點相比，Nrf2核蛋白在術后6 h表達即開始升高與假手術6 h比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，隨后逐漸升高，1 w達到高峰，2 w開始逐漸回落，4 w和8 w Nrf2核蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與假手術組相比仍較高水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HO-1蛋白在6-OHDA造模后6 h無明顯升高，與假手術組6 h比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，24 h升高，與假手術24 h，與PD造模術后6 h比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，隨后逐漸升高，1 w達到高峰，2 w開始逐漸回落，4 w和8 w蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但仍高于假手術組(P<0.01)。見表1，圖1。

組別時間點Nrf2/LaminHO?1/GAPDH假手術組6h0 024±0 0070 190±0 02024h0 026±0 0070 193±0 01948h0 024±0 0051)0 195±0 0231w0 025±0 0061)0 197±0 0212w0 024±0 0051)0 200±0 0154w0 026±0 0071)0 196±0 0218w0 026±0 0051)0 194±0 022模型組6h0 032±0 0041)0 196±0 02424h0 048±0 0072)0 242±0 0122)48h0 070±0 0083)0 294±0 0193)1w0 144±0 0074)0 562±0 0414)2w0 118±0 0075)0 503±0 0275)4w0 095±0 0066)0 401±0 0216)8w0 092±0 0070 391±0 014

與假手術6 h組比較：1)P<0.05；與模型6 h組比較：2)P<0.01；與模型24 h組比較：3)P<0.01；與模型48 h組比較：4)P<0.01；與模型1 w組比較：5)P<0.01；與模型2 w組比較：6)P<0.01

A為模型組，B為假手術組圖1 Western印跡檢測大鼠左側中腦黑質區(qū)Nrf2核蛋白、HO-1蛋白的表達

3 討 論

雖然PD發(fā)病機制目前并不十分清楚，但既往研究中大家一致肯定氧化應激損傷在黑質多巴胺能神經元凋亡中起到關鍵作用〔2〕。在正常情況下機體中存在谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等自由基清除系統(tǒng)，以確保機體免受氧化應激損傷。PD患者腦內ROS生成較正常人明顯增多。ROS可以通過直接誘導蛋白質主鏈和側鏈的氧化，也可以通過脂質過氧化間接誘導蛋白質氧化，大量ROS破壞機體氧化-抗氧化平衡，機體失去正常調節(jié)功能。機體抗氧化系統(tǒng)較為復雜，但幾乎都與Nrf2相關，其在參與細胞抗氧化應激和外源性有毒物質誘導的主要防御機制中發(fā)揮重要作用，是外源性有毒物質和氧化應激的感受器，是調節(jié)細胞內眾多抗氧化物表達的關鍵性因子。其中Keap1-Nrf2-ARE信號通路是機體內重要的抗氧化通路，其能夠被外界各種氧化應激條件誘導。Keap1是Nrf2在細胞質中的結合蛋白，正常情況下兩者相互結合，使Nrf2錨定在細胞質處于失活狀態(tài)，無法進入細胞核，從而抑制Nrf2活性〔3〕。但在氧化應激狀態(tài)下，親電子物質與Keap1的半胱氨酸殘基反應，引起Keap1構象發(fā)生變化，與Nrf2解離。另外蛋白激酶直接磷酸化Nrf2的方式促使其與Keap1分離，激活Nrf2。轉錄因子Nrf2轉位進入細胞核和肌腱纖維瘤蛋白(Maf)以異二聚體形式結合，之后與ARE結合，并誘導下游靶基因表達。受調控的靶基因主要包括多種解毒酶、抗氧化相關基因以及蛋白質修復相關的信號通路，如谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、NAD(P)H：醌氧化還原酶Ⅰ、HO-1。Nrf2是CNC轉錄因子家族成員之一，被認為是活力最強的轉錄調節(jié)因子〔4〕。其中HO-1存在于宿主幾乎所有細胞中，對宿主細胞具有重要調節(jié)作用，可以催化血紅素生成鐵離子、CO、膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶作用下形成膽紅素。HO-1主要通過其催化血紅素分解而產生的三種物質而發(fā)揮保護作用〔5〕。實驗研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子被認為是細胞內具有抗氧化損傷能力的保護劑，是神經系統(tǒng)內重要鐵貯存蛋白，其重鏈具有抗氧化酶的活性〔6〕。膽紅素、膽綠素具有抗氧化能力，是體內自由基清除劑〔7〕。

Nrf2、HO-1蛋白組成內源性保護系統(tǒng)參與體內的抗氧化應激損傷，在神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多個系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。如果該通路失活則導致氧自由基在體內積累，產生多種疾病，神經系統(tǒng)退行性病變就是其中之一。有研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)細胞中過表達Nrf2，能夠保護細胞減輕NO，H2O2和谷氨酸所導致的氧化應激損傷〔8,9〕。另有研究發(fā)現(xiàn)Nrf2缺失導致細胞保護基因的表達降低，從而也增強了神經元與星狀細胞對氧化應激的敏感性〔10,11〕。因此可以推測上調Nrf2活性能夠減輕氧化應激損傷。Shih等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)小鼠在發(fā)生腦缺血后，腦組織內Nrf2表達增加，通過激活Nrf2/ARE通路增加腦組織內GSH含量，減輕缺血帶來的損傷。因此本實驗結果提示Nrf2核蛋白在6-OHDA所致PD大鼠模型的早期即被激活，隨后調控下游靶基因HO-1蛋白表達水平上調，說明神經毒性物質6-OHDA注射紋狀體后，術后早期機體應對神經毒性物質的內源性防御機制被激活，內源性抗氧化系統(tǒng)關鍵因子Nrf2及下游靶基因HO-1蛋白表達上調。氧化應激作為PD重要發(fā)病機制之一，Nrf2、HO-1蛋白對防御和減輕氧化應激損傷具有重要作用，尤其Nrf2作為調節(jié)細胞內許多抗氧化物表達的關鍵性因子，在維持細胞氧化-抗氧化平衡，抑制細胞凋亡的過程中起到重要作用。利用Nrf2表達及轉錄的調節(jié)，上調其表達，誘導其下游調控多種抗氧化酶、解毒酶的表達，從而提高機體抗氧化能力，期望能夠成為PD治療的關鍵靶點。

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〔2015-03-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

廣東省中醫(yī)藥局建設中醫(yī)強省科研課題(No.20132150)

雒曉東(1961-)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導師，主要從事中醫(yī)藥治療帕金森病的臨床研究。

孫玉芝(1978-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事中醫(yī)藥治療帕金森病的臨床與實驗研究。

R3

A

1005-9202(2016)24-6051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.24.002

1 廣州中醫(yī)藥大學 2 中山市黃圃人民醫(yī)院