血漿游離DNA定量檢測在胃癌診斷中的價值

白艷麗　金建軍　劉獻民　田笑笑

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血漿游離DNA定量檢測在胃癌診斷中的價值

白艷麗金建軍劉獻民田笑笑

【摘要】目的 探討血漿游離DNA定量檢測在胃癌診斷中的價值。方法 收集33例胃癌患者、44例健康對照者血液標本，血漿微量DNA抽提試劑盒提取血漿游離DNA，實時熒光定量PCR檢測血漿游離DNA含量，評價血漿游離DNA水平在胃癌的診斷中的價值。結果 胃癌組血漿游離DNA水平高于對照組（P＜0．001）；胃癌敏感性和特異度分別72．7%和93．2%，ROC曲線下面積為0．902。TNM Ⅲ期患者血漿游離DNA水平高于Ⅰ/Ⅱ期患者（P＜0．05）。結論 血漿游離DNA定量檢測對胃癌的診斷具有一定的臨床意義。

【關鍵詞】胃癌；血漿游離DNA；實時熒光定量PCR；診斷

Objective To explore the cell-free DNA in the plasma of patients withgastric cancer and evaluate its diagnostic value． Methods The plasma cellfree DNA of 33 patients with gastric cancer and 44 controls were extracted and purified by TIANamp Macro DNA Kit． Quantitation of plasma DNA was performed by realtime fluores-cence quantitative PCR． ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of plasm cell-free DNA for gastric cancer．Results The level of plasma cell-free DNA of patients was significantly higher than that of the controls． In addition，plasma cell-free DNA level was associated with TNM stage（P＜0．05）． Conclusion Quantification of plasma cell-free DNA may be a valuable tool in the diagnostics of gastric cancer．【Key words】 Gastric cancer，Plasma cell-free DNA，RT-qPCR，Diagnosis

近年流行病學調查資料顯示，胃癌發病率居全國各類惡性腫瘤第2位，死亡率居第3位［1］。本研究收集本院2014年10月～2015年7月收治的33例胃癌患者，對患者血漿游離DNA進行定量檢測，分析其在胃癌診斷中的價值，現報告如下。

1　資料與方法

1. 1一般資料

胃癌組：收集本院2014年10月～2015年7月收治的33例胃癌患者，男22例，女11例，平均年齡（63.18±10）歲。依據最新胃癌國際TNM分期，Ⅰ/Ⅱ期21例、Ⅲ期12例，其中早期12例，進展期21例。所有病例均經病理確診。對照組：44例健康對照為同期本院胃鏡檢查的健康人或慢性淺表性胃炎患者，男20例，女24例，平均年齡（51.55±10）歲。二組一般資料具有可比性。

1.2標本采集及血漿游離DNA提取

所有患者胃鏡檢查前采集靜脈血2 ml置于EDTA-K2抗凝采血管，對照組同樣方法及流程采集靜脈血。血漿游離DNA提取：采用TIANamp Macro DNA Kit試劑盒，嚴格按照說明書操作步驟進行。所有血漿標本均采用同一批號的試劑盒提取DNA，以減少批間誤差。

1.3血漿游離DNA定量檢測

以提取的血漿游離DNA為模版，應用Applied Biosystems HT7900擴增儀及SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（TaKaRa）進行PCR擴增。標準曲線由同張反應板上的已知濃度的人類基因組DNA（Promaga）分別稀釋10倍、100倍、400倍、800倍、1 600倍后，在以上反應體系和反應條件下擴增所得。

1.4統計學處理

應用SPSS 18.0統計軟件對所得數據進行統計學分析，計量資料用（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間差異應用One-Way ANOVA。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1胃癌組與對照組血漿游離DNA含量

33例胃癌患者血漿游離DNA含量為（50.66±24.59）ng/ml， 44例健康體檢者血漿游離DNA含量為（19.13±7.65）ng/ml。胃癌患者的血漿游離DNA含量水平顯著高于對照組（t=8.018，P＜ 0.05）。對胃癌患者組和對照組血漿游離DNA定量結果進行ROC曲線分析。以29.83 ng/ml為診斷胃癌的臨界值，敏感性為72.7%，特異性為93.2%，ROC曲線下面積（AUC）為0.902，95% CI為0.835 ～0.968。

2.2胃癌組不同臨床病理特征與血漿游離DNA含量之間的關系

不同性別、＜60歲和≥60歲組間、不同分化程度組間血漿DNA游離含量均無差異；在早期和進展期胃癌組間亦未發現血漿DNA游離水平有差異。在不同TNM分期組間對比時發現，Ⅲ期患者血漿游離DNA水平（65.90±25.32）ng/ml高于TNMⅠ/Ⅱ期患者（41.95±19.90）ng/ml。

3　討論

目前，惡性腫瘤發生發展過程中游離核酸水平增高的機制目前還未完全闡明，一般認為，游離核酸釋放入血與腫瘤微環境中腫瘤細胞的凋亡和壞死等有關［2-3］。鑒于血漿在凝血過程中存在淋巴細胞破裂釋放DNA等影響游離DNA水平的因素［4］，本研究選用了更能體現機體血液游離DNA的血漿［5］。本研究結果顯示，胃癌患者組血漿游離DNA水平高于健康對照組。這表明血漿游離DNA含量診斷胃癌較為可靠。TNM Ⅲ期組的游離DNA水平高于TNMⅠ～Ⅱ期組和淋巴結無轉移組。這提示在某種程度上血漿游離DNA在胃癌早期診斷中具有一定的臨床意義。

除惡性腫瘤以外的其他病理及生理性變化［6］，如妊娠、炎癥性疾病、自身免疫性疾病等都能引起血漿游離核酸水平不同程度的升高［7］。所以單純依靠游離DNA水平診斷胃癌還是不夠準確的。血漿游離DNA水平檢測在胃癌的診斷和篩查中具有一定的臨床意義。雖然目前單純依靠血漿游離DNA診斷胃癌還不夠可靠，但隨著各項相關研究的不斷深入，血漿游離DNA能夠更加有效的指導胃癌及其他惡性腫瘤篩查、診斷、病情監測及療效評估。

參考文獻

［1］ 陳萬青，張思維，曾紅梅，等． 中國2010年惡性腫瘤發病與死亡［J］．中國腫瘤，2014（1）: 1-10．

［2］ Gahan PB，Swaminathan R． Circulating nucleic acids in plasma and serum． Recent developments［J］． Ann N Y Acad Sci，2008（1137）: 1-6．

［3］ Choi JJ，Reich CF 3rd，Pisetsky DS． The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA from apoptotic and necrotic cells［J］． Immunoloqy，2005，115（1）: 55-62．

［4］ Jung M，Klotzek S，Lewandowski M，et al． Changes in concentration of DNA in serum and plasma during storage of blood samples［J］． Clin Chem，2003，49（6 Pt 1）: 1028-1029．

［5］ 張蓓，沈立松． 實時熒光定量PCR的研究進展及其應用［J］． 國外醫學（臨床生物化學與檢驗學分冊），2003，24（6）: 327-329．

［6］ Swaminathan R，Butt AN． Circulating nucleic acids in plasma and serum: recent developments［J］． Ann N Y Acad Sci，2006（1075）: 1-9．

［7］ Fleischhacker M，Schmidt B． Circulating nucleic acids（CNAs）and cancer--a survey［J］． Biochim Biophys Acta，2007，1775（1）: 181-232．

Quantitative Analysis of Plasma Cell-free DNA and Its Clinical Value in the Diagnosis of Gastric Cancer

BAI YanliJIN JianjunLIU XianminTIAN XiaoxiaoDepartment of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，China

【Abstract】

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．01．118

【中圖分類號】R446

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）01-0161-02

作者單位：471000 洛陽，河南科技大學第一附屬醫院消化內科