TGF-β-Smad通路及相關因子在肺纖維化中的“串話”現象*

張　秀綜述，胡　靜審校（.上海中醫藥大學，上海20203；2.上海中醫藥大學基礎醫學院溫病教研室，上海20203）

·綜述·

TGF-β-Smad通路及相關因子在肺纖維化中的“串話”現象*

張秀1綜述，胡靜2△審校（1.上海中醫藥大學，上海201203；2.上海中醫藥大學基礎醫學院溫病教研室，上海201203）

轉化生長因子β；肺纖維化；信號傳導；綜述

肺纖維化也稱為間質性肺疾病（ILD）或彌漫性實質性肺疾病（DPLD），包括200多個臨床病種［1］，雖然每一種疾病都有其自身的特點和基本機制，但存在一個共同的定律，即在肺部損傷修復過程中，纖維原性和抗纖維原性兩大類細胞因子作用失衡，進而導致肺纖維化的形成。因此，研究導致肺纖維化的有效因子及通路成為當前醫學界研究的熱點。肺纖維化最主要的效應細胞是肺成纖維細胞，在轉化生長因子β1（TGF-β1）介導下的Smad通路與非Smad通路激活調控下發揮作用［2-3］。現就近年來關于TGF-β1下游信號傳導通路與相關因子的對話聯系作一綜述。

1　TGF-β1與肺纖維化

TGF-β1主要分布于支氣管上皮細胞、增生的肺泡上皮細胞（Ⅱ型）、巨噬細胞及間質細胞，在肺纖維化中充當重要的刺激信號［4-5］。其以無活性前體形式存在，需經活化才具有生物學活性，而活性的發揮又有賴于正常的信號傳導途徑。研究表明，TGF-β1可引起成纖維細胞活化，膠原合成、沉積并致纖維化，在多數細胞的免疫調節、創傷修復、胚胎發生、細胞凋亡等過程中發揮不同的功能，特別是損傷部位的TGF-β1能夠從損傷部位周圍募集成纖維細胞，刺激未成熟的成纖維細胞增生和分化，直接導致纖維化后期的細胞外基質（ECM）過量沉積［6-7］。而肌成纖維細胞（MFB）構成成纖維細胞灶，其合成膠原纖維的能力是成纖維細胞的4～5倍，是造成ECM異常沉積的主要細胞。因此，對α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達水平的檢測可以間接反映MFB的增殖［8-9］。

TGF-β1作為關鍵的致纖維化因子，可導致多臟器如肝腎纖維化、動脈粥樣硬化等。成纖維細胞受刺激后合成膠原蛋白纖維連接蛋白等成分，以此來抑制和降解蛋白酶的產生。Mi等［10］研究指出，依賴于TGF-β1的機制來增加肺泡上皮膠原蛋白的合成和分泌，促進上皮-間質轉化；同時，這種依賴性和非依賴性機制通過阻斷白介素（IL）-17A來消除肺部炎癥和纖維化，以保持細胞網絡的平衡。

膠原代謝失衡是ECM過度沉積的主要標志，其中起主要作用的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，Ⅲ型膠原過度沉積尚可逆轉，Ⅰ型膠原過度沉積導致的肺纖維化則不可逆轉。目前在膠原合成中最有效的刺激劑是TGF-β1，其也是修復肺間質的關鍵因子，可刺激MFB的生成與凋亡，標志著活動性肺纖維化的出現［11-12］。

研究表明，自身肺成纖維細胞的增殖，肺泡上皮的間質表型轉化及骨髓來源的纖維細胞的轉化構成了肺成纖維細胞的主要來源［13］。其中循環中的纖維細胞分泌的細胞外基質蛋白介導了心、肝、肺等多器官的纖維化，但其遷移、收縮和形成能力遠大于成纖維細胞，是該過程中的作用細胞。以往的實驗研究也證明，靶器官間質細胞的分化可以通過TGF-β1與Smads蛋白、蛋白激酶A、細胞外信號調節激酶等通路實現［14］。

2　TGF-β1信號轉導通路

TGF-β與其他信號途徑具有以下交互作用：TGF-β的多條傳導通路（主要是Smads）與其他蛋白質作出直接和動態的接觸；TGF-β有很多目標基因發生轉錄和非轉錄活動［15-16］。但TGF-β1需要通過其受體介導才能激活相應的信號轉導通路。受體共分為3型，其中Ⅰ型受體廣泛分布于間質成纖維細胞、支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞及血管壁平滑肌細胞內，在間質纖維化區域有較多表達。TGF-β1首先與Ⅱ型受體結合，被活化的Ⅱ型受體使Ⅰ型受體的絲甘氨酸（GS）序列結構域磷酸化后，與Ⅰ型受體形成異源三聚體復合物，激活下游的信號轉導通路［17-18］。總之，TGF-β1的信號轉導通路可分為Smads蛋白通路和非Smads蛋白通路，其中非Smads蛋白通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路與TGF-β1的關系密切［19］。

2.1非Smads蛋白通路MAPKs屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，胞外信號的不同會引起多條信號通路的活化。三級酶促級聯反應（即MAPKKK-MAPKK-MAPK）是一種不斷激活的信號傳遞反應，細胞外刺激通過某些環節使MAPK激酶的激酶（MAPKKK）激活，轉而激活MAPK激酶（MAPKK）；然后通過對蘇氨酸和酪氨酸雙位點的磷酸化，激活MAPK將外界信息轉導到細胞核內，并激活其細胞骨架蛋白酶類及下游轉錄因子，調節細胞增殖、分化及凋亡，并與炎癥、癌癥等多種疾病密切相關。在哺乳動物細胞內至少發現了4種MAPK家族成員，即ERK、JNK、p38和大絲裂原活化蛋白激酶1/細胞外調節蛋白激酶5（BMK1/ERK5），這些通路之間形成一個復雜的轉導網絡［20］。

2.1.1ERK通路ERK1/2是一種脯氨酸導向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能被生長因子刺激激活。研究發現，在小鼠肺上皮細胞及乳腺上皮細胞中，ERK MAPK磷酸化Smad2和Smad3的DNA結合域和轉錄激活結構域可以活化致癌性的Ras來達到抑制TGF-β1的抗增殖作用；相反，通路的串話能夠促進TGF-β1作用的發揮［21］。如在NIH/3T3細胞中，ERK2可以促進TGF-β1合成膠原纖維，但其實現需要部分活化Smad2連接區，同時干擾ERK2后，降低了Smad2的活性，相應的TGF-β1誘導的膠原表達也會大幅減少；重要的是，纖維化時大鼠肺的α-SMA和ERK磷酸化（p-ERK）蛋白水平明顯升高，Rasp21表達水平也上調，且Rasp/ERK通路在TGF-β1型受體的誘導下促進膠原合成，提示Smad和ERK通路之間在合成膠原上也存在著聯合作用［22］。

2.1.2c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路在受到刺激時，細胞內的JNK發生磷酸化而被激活，可部分由細胞質向細胞核移位后進一步磷酸化下游底物核內原癌基因（cjun），使其轉錄活性增強，形成c-jun轉錄因子蛋白，并與亮氨酸拉鏈結構結合形成異源或同源二聚體，形成轉錄調控激活蛋白-1（AP-1），細胞信號被傳遞，進而調控細胞的增殖和分化過程［23］。Wu等［24］在LMNA基因插入小鼠（Lmna H222P/H222P）模擬人家族性擴張性心肌病模型中，給予JNK信號轉導通路抑制劑（SP600125）干預，發現SP600125能夠下調磷酸化-JNK蛋白和Ⅰ型膠原基因的表達，減輕心肌間質的纖維化和心臟的擴張程度，同時增強了心臟的收縮功能。Galuppo等［25］也發現，當應用MAPK通路抑制劑（PD98059）干預博來霉素誘導的肺纖維化小鼠時，PD98059減少了磷酸化-ERK和磷酸化-JNK蛋白炎癥因子（如腫瘤壞死因子-α、IL-1β）等表達，減輕了肺的炎性反應和間質纖維化程度，對博來霉素導致的肺損傷具有保護作用。

2.1.3P38通路TGF-β1通過受體介導促使磷酸化P38蛋白表達增加并發生由細胞質向細胞核的轉位，激活P38MAPK信號轉導通路，進而誘導和刺激肺成纖維細胞合成膠原蛋白。當應用TGF-β1受體特異性阻斷劑干預后，肺成纖維細胞的TGF-β1Ⅰ型受體和Ⅱ型受體的mRNA和蛋白表達水平明顯下降，磷酸化的P38蛋白在細胞核內的分布與表達減少，細胞質內的分布與表達增高，核質比值下降，而Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達水平也被下調，可以說TGF-β1受體阻斷劑在有效阻斷受體活性和表達的同時，通過抑制P38MAPK蛋白的核轉位，阻抑了P38MAPK信號轉導通路的激活，并使肺成纖維細胞膠原蛋白的合成與表達減少，也進一步證實了TGF-β1受體的介導在激活P38MAPK信號轉導通路及其在肺纖維化形成過程中發揮著重要作用。

2.2Smads蛋白依賴型通路Smad信號作為TGF-β1下游的一條重要通路，是通過細胞膜上的特異性受體將信號傳遞至細胞核內的中樞性傳遞分子，保守的氨基端MH1區、羧基端MH2區和多變的連接區構成了其的主要功能區域。富含脯氨酸的鏈接區上有多個磷酸化的位點，包括ERK磷酸化位點和MAPK磷酸化位點，可以導致多個信號轉導途徑的活化。同時，更多的研究發現，TGF-β1因子的轉錄表達在相互串話平行和（或）交叉的多條信號通路之間發生［26］。

目前共發現9種Smad蛋白，根據不同功能分為：抑制性Smad（I-Smads）、通用型Smad（Co-Smad）和受體激活型Smad（R-Smads）。TGF-β1首先與Ⅱ型受體結合并將其激活，再通過磷酸化途徑激活受體，活化的受體進一步磷酸化來激活Smad2、3。此時的Smad2、3形成二聚體，與Smad4連接形成三聚體，共同遷移到細胞核，間接或直接與靶基因結合以調節TGF-β1因子的轉錄活性。同時，激活核內ECM成分如纖維黏連蛋白、膠原等啟動子的活性，從而促進ECM成分的合成。這一復合物也可以引起抑制性Smad7蛋白的啟動子轉錄增加，并且Smad7可競爭性地與TGF-β1受體結合，反饋性地抑制Smad2，3磷酸化而起到調節作用［27］。

Smad7通過負性反饋并調控TGF-β1信號通路對靶基因的轉錄作用主要表現在：Smad7通過與Smad2/3競爭性結合而活化TGF-β1RI受體以抑制Smad2/3磷酸化，從而阻礙TGF-β1的信號轉導。有研究指出，Smad7參與了TGF-β1對ERK通路的活化，同時拮抗TGF-β1對JNK通路的活化，在交互的信號通路間發揮平衡作用［28］。此外，Smad4缺失也可以抑制TGF-β1對ERK/ MAPK通路的活化，在此基礎上，提出了TGF-β1活化ERK/MAPK通路同樣需要Smad4存在的假設［29］。

在 TGF-β/Smads形成與逆轉纖維化的過程中，Smads分子之間緊密協作，共同參與病理及生理狀態下TGF-β的生物學效應，且MAPK通路之間存在一定的串話。在不同的培養條件下，不同的細胞類型，其信號途徑之間可能會表現出不同的聯絡，這也證明了信號轉導的縱橫交錯。目前還沒有找到能防范肺成纖維細胞向MFB轉化這一關鍵環節的負調控因素［30］，如果能中止其分化，或是逆轉膠原合成，就有可能阻截纖維化的發展，以維持促纖維化細胞因子和抗纖維化細胞因子之間的平衡。

3　結語與展望

目前對TGF-β/Smad信號通路的研究已取得了大幅度進展，明確了抑制MFB募集和增殖分化方案可以成為治療肺間質纖維化的途徑之一，但對該通路下游基因的調控情況尚未完全清楚。鑒于信號網絡的復雜性和多樣性，應綜合多因素來評價TGF-β與其他信號（如骨形態發生蛋白、Wnt等信號）的級聯交互作用。隨著更多細胞因子的不斷研究，TGF-β與血小板源生長因子、結締組織生長因子、TNF-α、γ-干擾素等已交織成龐大的細胞信號轉導網絡，需要以此為基點，探索TGF-β功能和調節的最新領域。

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（2015-09-09）