原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內酯誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡中的作用

張　潔　周方舟　曹新冉　任宏生　楚玉峰　王愛紅　董　波　趙　鵬

(山東大學附屬省立醫院營養科，山東　濟南　250021)

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原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內酯誘導小鼠胚胎成纖維細胞凋亡中的作用

張潔周方舟1曹新冉1任宏生2楚玉峰2王愛紅1董波1趙鵬1

(山東大學附屬省立醫院營養科，山東濟南250021)

〔摘要〕目的探討原癌基因c-jun在毒胡蘿卜素內酯(TG)誘導的小鼠胚胎成纖維細胞凋亡中的作用及機制。方法應用TG處理野生型(c-jun+/+)，基因敲除型(c-jun-/-)和基因重組型(c-jun Re)小鼠胚胎成纖維細胞后觀察細胞生存率；流式細胞術(FACS)和DNA染色進行細胞凋亡分析；蛋白免疫印跡技術分析蛋白c-jun、caspase-12及內質網應激反應分子伴侶Grp78、 Gadd153和α-tubulin的表達；共聚焦顯微鏡觀察內質網染色及形態。結果不同濃度TG處理3組細胞4 h后觀察細胞生存率，TG在50 nmol/L及100 nmol/L時3組細胞生存率出現差異，c-jun+/+與c-jun-/-組較 c-jun Re組生存率減低(P<0.05);TG未處理與處理均未影響c-jun蛋白的表達，c-jun-/-無c-jun蛋白表達，c-jun Re高表達c-jun蛋白；FACS與DNA染色結果顯示，TG處理后c-jun-/-組較c-jun Re組DNA含量增高(P<0.05)，并在c-jun-/-組出現典型的凋亡細胞亞二倍體DNA；熒光顯微鏡下觀察細胞DAPI染色，與c-jun Re組比較c-jun-/-組DNA染色弱且模糊紊亂；在c-jun+/+與 c-jun-/-組中12 h比24 h caspase-12蛋白表達低(P<0.05)，與c-jun+/+組比較，c-jun-/-組caspase-12蛋白表達明顯增高(P<0.05)，而在c-jun Re組幾乎無caspase-12蛋白表達；經TG處理后，內質網應激反應分子伴侶Grp78和Gadd153，c-jun Re組此兩種標識物的表達明顯低于其在c-jun-/-組中的表達，并發現了內質網構造在兩種細胞中的不同樣式，c-jun Re組相比c-jun-/-組內質網結構更加完整豐富寬廣。結論TG可以引起小鼠成纖維細胞出現細胞凋亡。c-jun基因表達的不同改變了細胞凋亡的程度，這種改變是通過細胞對內質網應激反應的介導。c-jun基因的表達在TG誘導的小鼠成纖維細胞凋亡中起保護作用。

〔關鍵詞〕c-jun基因；毒胡蘿卜素內酯；內質網應激；細胞凋亡

1心內科2ICU

第一作者：張潔(1985-)，女，碩士，主治醫師，主要從事心臟病的臨床與基礎研究。

c-jun是一種核內原癌基因，c-jun氨基末端激酶(JNK)的活化是通過c-jun氨基末端殘基磷酸化實現的，一旦被激活，胞質中的JNK移位到細胞核中〔1〕。激活的JNK可進一步使核內c-jun等轉錄因子活性增強，主要以c-jun為底物并提高激活蛋白(AP)-1的轉錄活性。內質網應激是調節細胞生存和死亡的重要過程，內質網中的分子伴侶提供有利于蛋白質折疊的特殊環境。起主導作用的內質網伴侶結合蛋白/葡萄糖相關蛋白質78 kD蛋白(BiP/Grp78)在儲存內質網Ca2+中起著重要作用，各種刺激因子如毒胡蘿卜素內酯(TG)、肌漿/內質網Ca2+/ATP酶抑制劑促進有效的未折疊蛋白質應答(UPR)〔2〕發生時，內質網激活某些UPR靶基因，如促凋亡基因生長停滯DNA損傷基因(Gadd153)的表達〔3〕。本研究應用c-jun基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(c-jun-/-)、c-jun重組表達細胞(c-jun Re)和野生型小鼠成纖維細胞(c-jun+/+)，探討內質網應激的改變，明確原癌基因c-jun在TG誘導的細胞凋亡中的作用及機制。

1材料與方法

1.1細胞培養處理和存活率檢測c-jun-/-細胞和c-jun Re細胞由美國Michael Karin博士的實驗室提供，c-jun+/+細胞由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)提供。培養基為加入了10%小牛血清(Life Technologies.Inc)的DulBecco改良Eagle培養基。利用臺酚藍染料排除法評估細胞存活率。

1.2流式細胞術(FACS)和DNA染色進行細胞凋亡分析小鼠成纖維細胞從TG處理24 h后的60 mm組織培養皿中取出。上清液收集在15 ml錐形管中，用0.05%的胰蛋白酶對貼壁細胞處理10 min使其分散開，然后用血清培養基終止消化。將兩種成分混合，2 500 r/min離心5 min。再懸浮細胞，在4 ml 1%多聚甲醛磷酸緩沖鹽水(PBS)中固定30 min，4℃再次離心，并再懸浮于1 ml PBS中。用血細胞計數器對細胞進行計數，確保在隨后的每一步中細胞濃度為1×106個/ml。以0.1% 的Triton X-100 PBS在4℃條件下將細胞通透3 min。再次離心后，將細胞重新懸浮在DNA 染色溶液(50 mg/ml，碘化丙啶，PI)中30 min。應用FACScan系統完成細胞周期分析。

利用DAPI對DNA染色。用PBS沖洗細胞并用胰蛋白酶-EDTA消化。將約5萬個細胞重懸浮在50 μl PBS中，然后將100 μl的22%牛血清白蛋白(BSA)溶液加入到樣品中。將這種懸浮液放入CYTO離心機中以500 r/min離心5 min。室溫下載玻片風干30 min后用PBS洗滌。在室溫條件下用DAPI(200 μl 2.5 μg/ml PBS)處理30 min，然后用PBS洗滌，將樣品存儲在4℃避光環境中，利用熒光顯微鏡進行觀察。

1.3內質網染色及共聚焦顯微鏡觀察細胞在100 nmol/L Dioc6染料內質網熒光探針(Invitrogen，Carlsbad，CA)中孵育30 min，然后將載有細胞的共聚焦顯微鏡專用蓋玻片轉移到BioRad MRC-1024共聚焦顯微鏡(Hercules，CA)，使用63×1.4數值孔徑(N.A.)的物鏡觀察。內質網熒光探針在波長790 nm處由雙光子激發，然后用特定的外部探測器在500~540 nm波長處進行熒光觀察。

1.4蛋白免疫印跡分析用蛋白免疫印跡技術分析蛋白c-jun、caspase-12及內質網應激反應分子伴侶Grp78、 Gadd153和α-tubulin的表達。多克隆抗c-jun抗體及單克隆抗caspase-12抗體購自Cell Signaling公司(Beverly，MA)，多克隆抗Grp78抗體及多克隆抗Gadd153 抗體和多克隆抗α-tubulin抗體購自Santa Cruz Biotechnology 公司(CA)。將小鼠成纖維細胞在冷PBS中洗滌2次后再在1 ml裂解緩沖液〔1%Triton X-100，20 mmol/L HEPES(pH7.4)，50 mmol/L β-甘油磷酸鹽，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，10 mmol/L氟化鈉，1 mmol/L原釩酸鈉，10%甘油和蛋白酶抑制劑混合物〕中溶解。 將細胞裂解物在14 000 r/min離心10 min后澄清。用布拉德福德蛋白測定法定量蛋白濃度。通過電泳將蛋白標本在直或梯度的NuPAGE Bis-Tris凝膠(10或4%~12%)(Invitrogen，Carlsbad，CA)進行解析，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，MA)上。用增強化學發光試劑檢測免疫反應帶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。用含50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，2%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1 mol/L β-巰基乙醇對印跡進行清除，然后重新標記，免疫反應帶的濃度用掃描密度儀和酶標儀聯合測量。

2結果

2.1不同濃度TG處理后細胞生存率及TG處理細胞后c-jun蛋白的表達應用不同濃度TG(0、10、50、100 nmol/L)處理c-jun+/+組、c-jun-/-組和c-jun Re組細胞4 h，發現TG在50及100 nmol/L濃度時3組細胞生存率出現差異，c-jun+/+與c-jun-/-組較 c-jun Re組生存率減低(圖1A)。c-jun+/+、c-jun-/-和c-jun Re 3組細胞用TG(100 nmol/L)未處理與處理4 h后c-jun-/-細胞無c-jun蛋白表達，c-jun Re細胞高表達c-jun蛋白(圖1B)。

圖1　不同濃度TG處理后細胞生存率(A)及TG處理與未處理3組小鼠成纖維細胞c-jun表達(B)

2.2TG處理細胞后檢測細胞凋亡將c-jun-/-和c-jun Re兩組細胞用TG(100 nmol/L)處理與未處理4 h，c-jun-/-組較c-jun Re組DNA含量增高(28.9%±3.6% vs.2.6%±0.3%，P<0.05)，并在c-jun-/-組出現典型的凋亡細胞亞二倍體DNA(圖2A)。熒光顯微鏡下觀察細胞DAPI染色，與c-jun Re組比較c-jun-/-組DNA染色弱且模糊紊亂(圖2B)。

圖2　TG處理c-jun-/-和c-jun Re細胞4 h后凋亡結果

2.3TG誘導細胞凋亡蛋白caspase-12的表達經TG(100 nmol/L)處理4 h后，c-jun+/+與 c-jun-/-組12 h比24 h caspase-12蛋白表達低(1.4±0.1 vs.2.2±0.3；2.8±0.3 vs.10.1±2.7；P<0.05)，與c-jun+/+比較，c-jun-/-組caspase-12蛋白表達明顯增高(P<0.05)，而在c-jun Re組幾乎無caspase-12蛋白表達。見圖3。

圖3　TG(100 nmol/L)誘導3組小鼠成纖維細胞caspase-12的表達

2.4TG處理細胞后內質網應激蛋白的表達及內質網形態改變經TG(100 nmol/L)處理后，c-jun Re細胞的Grp78和Gadd153表達明顯低于c-jun-/-細胞(圖4A)。內質網熒光探針檢查發現內質網構造在兩種細胞中不同，c-jun Re細胞相比c-jun-/-細胞內質網結構更加完整豐富寬廣(圖4B)。

(A)免疫印跡技術檢測內質網應激標記蛋白Grp78和Gadd153及c-jun的表達；(B)激光共聚焦顯微鏡觀察內質網形態圖4　TG處理c-jun-/-和c-jun Re細胞4 h后內質網應激標記蛋白、c-jun及內質網形態觀察

3討論

UPR增加了內質網固有的分子伴侶的表達，以適應內質網中因蛋白折疊的需求。內質網在細胞功能和存活方面起著重要的作用。細胞應對內質網應激的基礎反應便是包括JNK信號通路在內的多種應激活化的激酶途徑。c-jun作為一種JNK的下游靶分子，在許多刺激下如生長因子、紫外照射和細胞因子的刺激下c-jun的表達都會增強〔4〕。c-jun在細胞內質網應激中具有保護作用，c-jun-/-小鼠胚胎成纖維細胞在TG刺激后有部分發生了細胞凋亡，然而轉染重組c-jun基因的小鼠胚胎成纖維細胞卻對TG有一定的抵抗作用。本文結果說明了c-jun的重組再表達明顯地增加了細胞對于TG所致的內質網應激的耐受性，而且內質網相關的caspase-12參與了細胞凋亡的局部調節。在c-jun-/-細胞中TG刺激引起了caspase-12的活化，正如caspase-12前體裂解一樣，并具有一定的時間依賴性。與此相反，在野生型和轉染重組c-jun基因的小鼠細胞，對于TG引起的caspase-12激活具有一定抵抗性。我們應用內質網熒光探針測試兩種細胞中的內質網構造，發現了內質網構造在兩種細胞中的不同樣式，表明c-jun的結構性再表達能增加細胞對于TG誘導的內質網應激的耐受性。

內質網是多數細胞內、細胞表面和細胞外蛋白質合成、加工和轉運的主要場所。內質網非常敏感，Ca2+耗竭、葡萄糖或營養缺乏、蛋白質糖基化抑制、二硫鍵形成障礙、蛋白質轉運異常等刺激均可導致內質網功能失調，即內質網應激。內質網應激發生后，腔內大量蛋白質堆積引發了真核生物進化中高度保守的UPR。內質網應激可促進內質網對蓄積在網腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白的處理，而有利于維持細胞的正常功能并使之存活，但是時間過長的內質網應激可引起細胞的凋亡。內質網應激時的UPR信號通路通過三個分子介導：肌醇內質網跨膜激酶IRElα、蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)和活化轉錄因子6(ATF6)。生理條件下，它們與內質網腔中的Grp78牢牢結合；當內質網應激時，大量未折疊蛋白質被釋放活化并發揮作用。UPR引起IRE1α、PERK和ATF6 活化，分別產生了b-ZIP 轉錄因子XBP-1、ATF4 和p50ATF6，調控促凋亡基因CHOP的轉錄〔5〕，介導調整轉錄和翻譯水平。未折疊蛋白在細胞內的聚集對細胞是一種損害，如果上述的PERK，ATF6和IRE1α三種調節途徑不能抑制內質網應激，內質網應激介導的凋亡途徑將被激活。Gadd153，即C/EBP同源蛋白(CHOP)，是一種轉錄因，通過ERS的ATF6和PERK途徑誘導表達的。Gadd153可以激活Gadd34，DR5等基因的表達。DR5是一種細胞表面的死亡受體,可以激活caspase的級聯反應。caspases-12參與了內質網應激誘導的細胞凋亡，caspase-12位于內質網膜，內質網應激時可被激活〔6〕。內質網應激時IRE1α能活化c-jun-N-末端抑制性激酶,進而激活JNK。JNK可使TNAF-2磷酸化，磷酸化TNAF-2與IRE1α形成復合物使TNAF-2與caspase-12前體解離，導致caspase-12活化，誘導細胞的凋亡〔7〕。齊曉丹等〔8〕的研究發現抗氧化劑肌肽拮抗高糖誘導的心肌細胞凋亡與抑制p-JNK/p-c-jun 表達有關系。

綜上所述，本研究表明TG可以引起小鼠成纖維細胞凋亡，c-jun基因表達的不同改變了細胞凋亡的程度，這種改變是通過細胞對內質網應激反應的介導，c-jun基因的表達在TG誘導的小鼠成纖維細胞內質網應激反應中起保護作用。

4參考文獻

1Maki Y,Bos TJ,Davis C,etal.Avian sarcoma virus 17 carries the jun oncogene〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1987;84(9):2848-52.

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3Van Huizen R,Martindale JL,Gorospe M,etal.P58IPK,a novel endoplasmic reticulum stress-inducible protein and potential negative regulator of eIF2alpha signaling〔J〕.J Biol Chem,2003;278(18):15558-64.

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8齊曉丹，張春晶，師巖，等.肌肽通過調節JNK 和NF-kappaB通路抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2014;30(2):156-62.

〔2016-05-11修回〕

(編輯李相軍)

The role of c-jun in thapsigargin-induced mouse fibroblast cell apoptosis

ZHANG Jie,ZHOU Fang-Zhou,CAO Xin-Ran,etal.

Department of Cardiology,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250021,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo examine the impact of c-jun on thapsigargin-induced fibroblast cell apoptosis and address the mechanisms.MethodsThe thapsigargin was used to treat c-jun-/- mouse fibroblast cells,wild-type mouse fibroblasts and reconstitution of c-jun expression in c-jun-/- cells(c-jun Re).Cell viability was evaluated by trypan blue dye exclusion.Apoptosis was detected by fluorescence activated cell sorting(FACS)and DNA staining.c-jun,caspase-12,Grp78,Gadd153 and α-tubulin were analyzed by immunoblotting.Confocal images of cells loaded with the ER-Tracker and visualized by two-photon microscopy.ResultsWild type(c-jun+/+),c-jun-/- and c-jun Re cells exhibited dramatic differences in sensitivity to TG.The c-jun-/- cells were the most sensitive,while c-jun Re cells were relatively resistant,to TG-induced cell death(P<0.05).TG treatment led to the activation of caspase-12,as indicated by the cleavage of procaspase-12,in c-jun-/- cells in a time-dependent manner.In contrast,caspase-12 activation was significantly attenuated in wild type fibroblast cells and abrogated in c-jun Re cells in response to TG treatment(P<0.05).c-jun-/- cells exhibited a large degree of apoptosis after treatment with TG,while c-jun Re cells demonstrated relative resistance to TG-induced apoptosis.c-jun-/- mouse fibroblast cells were more sensitive to TG-induced cell death compared to wild-type mouse fibroblasts,while reconstitution of c-jun expression in c-jun-/- cells(c-Jun Re)enhanced resistance to TG-induced cell death(P<0.05).The expression levels of ER chaperones Grp78 and Gadd153 induced by TG were lower in c-jun Re than those in c-jun-/- cells.ER-tracker found different patterns in the ER structure between c-jun-/- and c-jun Re cells.ConclusionsThapsigargin could cause mouse fibroblast cells apoptosis.c-jun gene expression changes of apoptosis degree,this change is mediated by endoplasmic reticulum stress.c-jun gene expression plays a protective role in thapsigargin-induced fibroblast cell apoptosis.

【Key words】c-jun;Thapsigargin;Endoplasmic reticulum stress;Apoptosis

通訊作者：趙鵬(1979-)，男，副主任醫師，碩士生導師，主要從事心臟病的臨床與基礎研究。

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目(81200176，81200238)；山東省科技發展計劃重點研發計劃(2015GSF118180)；山東省自然科學基金(ZR2013HM062)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)04-0772-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.002