熱療聯(lián)合5氟尿嘧啶對裸鼠移植性MKN45胃癌細胞凋亡的研究

楊衛(wèi)東 張祎 安琳 許敏 李海飛 李磊 郭芳 朱紅偉 王素絹 湯若琪

(1.保定市第二醫(yī)院，河北 保定 071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；3.河北醫(yī)科大學,河北 石家莊 050017)

?

熱療聯(lián)合5氟尿嘧啶對裸鼠移植性MKN45胃癌細胞凋亡的研究

楊衛(wèi)東1張祎1安琳2△許敏1李海飛1李磊1郭芳1朱紅偉1王素絹1湯若琪3

(1.保定市第二醫(yī)院，河北 保定 071000；2.河北大學附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；3.河北醫(yī)科大學,河北 石家莊 050017)

目的 探討熱療聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)化療對小鼠MKN45腫瘤模型細胞凋亡的影響。方法 建立裸鼠模型，分為空白對照組、5-FU、熱療組和熱療聯(lián)合5-FU。流式細胞儀測定凋亡率，免疫組化分析技術(ICH)測定瘤組織表皮細胞生長因子受體(EGFR)和凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表達變化。結果：熱療聯(lián)合5-FU組小鼠MKN45細胞凋亡率最明顯(P<0.05)，EGFR和Bcl-2蛋白降低最顯著(P<0.05)。二者表達呈正相關關系(R=0.914)。結論 熱療聯(lián)合5氟尿嘧啶能增加MKN45腫瘤細胞凋亡可能通過下調(diào)EGFR和Bcl-2的表達有關。

熱化療； 凋亡； EGFR； Bcl-2

腫瘤熱療是利用恒溫熱水浴加熱腫瘤組織，殺滅癌細胞治療惡性腫瘤的方法，近幾年得到快速發(fā)展[1-2]。因此熱療聯(lián)合化療治療腫瘤可以發(fā)揮協(xié)同作用[3]。本實驗觀察熱療聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)誘導細胞凋亡的作用。

1 材料及方法

1.1 實驗動物及分組 健康的雄性裸鼠40只，體質(zhì)量18～20 g，人胃癌細胞株MKN45。

1.2 實驗方法 裸鼠接種MKN45腫瘤細胞懸液，測瘤體生長至1 cm3時處理。空白對照組裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)， 5-FU化療組裸鼠腹腔注射5-FU 0.2 mg/只,熱療組予(43±0.2)℃恒溫水浴加熱1 h。熱化療組處理同上。處死小鼠，70%乙醇4 ℃固定保存瘤組織，用于流式細胞分析； 10%中性甲醛固定免疫組織化學染色分析。

1.3 檢測方法 流式細胞術分析 取1.0 mL單細胞懸液，加入10%雞紅細胞為內(nèi)參標準，加碘化丙啶(PI)，4 ℃冰箱中染色，上機測細胞凋亡率。免疫組織化學測定EGFR和Bcl-2蛋白表達 10%中性甲醛固定瘤組織，70%乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟至水，抗原修復，加EGFR和Bcl-2單克隆抗體，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為空白陰性對照，EGFR和Bcl-2陽性表達在細胞胞膜或胞漿呈棕黃色。染色范圍分0～4級：陰性為0，陽性細胞1%～25%為1， 26%～50%為2， 51%～75%為3，76%～100%為4。染色強度分為0～3級：陰性為0分，弱陽性為1分，中等強度為2分，強陽性為3分，積分為二者之和。計數(shù)10個視野。EGFR、Bcl-2指數(shù)PI=陽性細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)×100%

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS軟件進行單因素方差分析、直線相關與回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組流式細胞儀檢測情況 各組凋亡率分別為(2.00±0.02)，(16.91±0.09)，(7.50±0.16)，(28.64±0.09)熱療聯(lián)合5-FU的細胞凋亡率分別顯著高于熱療、5-FU化療組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 EGFR、Bcl-2蛋白表達測定 各組EGFR蛋白表達分別為(4.66±0.47)，(4.05±0.54)，(3.52±0.62)，(3.02±0.58)； Bcl-2蛋白分別為(4.00±0.76)、(3.70±0.77)，(3.40±0.74)，(3.00±0.53)；熱療聯(lián)合5-FU明顯降低EGFR 和Bcl-2蛋白表達 (P<0.05)。

3 討 論

胃癌是一種異質(zhì)性較強的消化系統(tǒng)常見腫瘤，其發(fā)病率居我國惡性腫瘤第三位，全球胃癌患者中約40%為中國居民[4]。5-FU為臨床主要應用于消化系統(tǒng)腫瘤的化療藥。5-FU可在細胞內(nèi)轉化成細胞毒性代謝產(chǎn)物，并與DNA和RNA結合，抑制DNA合成導致細胞周期阻滯和細胞凋亡。5-FU抑制NF-kappaB信號轉導和阻斷血管形成而抑制破骨細胞形成阻斷巨大細胞生長[5]。

EGFR是表皮細胞生長因子，它的過表達和腫瘤細胞的侵潤、種植、轉移、病人預后差有關。實驗結果[6-7]表明靶向EGFR/VEGFR2通路治療肺癌可誘導非小細胞肺癌細胞凋亡。Francisco Azuaje[8]發(fā)現(xiàn)靶向EGFR通路治療膠質(zhì)細胞瘤抑制耐藥。A.M Unni[9]研究表明降低聯(lián)合減低EGFR和RAS二者表達治療肺癌。Z.Zhang[10]應用YM155降低骨肉瘤細胞Bcl-2表達誘導凋亡。YM155成為治療骨肉瘤的新藥物[10]。

本實驗結果表明各處理組都可誘導腫瘤細胞凋亡，均可降低EGFR和Bcl-2的蛋白表達，熱療聯(lián)合5-FU化療組細胞凋亡率最高，EGFR和Bcl-2的蛋白表達最低。由此可提示熱療聯(lián)合化療有可能是通過下調(diào)EGFR和Bcl-2表達而誘導細胞凋亡。

[1] Lee SH,Jeong D,Han YS.Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis[J].2015,89(1):1-8.

[2] Shinya T,Yokota T,Nakayama S.Orally administered mucolytic drug L-carbocisteine inhibits angiogenesis and tumor growth in mice[J]. Pharmacol Exp Ther,2015,30:27.

[3] Schmitt O,Schubert C,Feyerabend T.Preferential topography of proteins regulating vascularization and apoptosis in a MX1 xenotransplant after treatment with hypoxia, hyperthermia, ifosfamide, and irradiation[J]. Am J Clin Oncol, 2002 ,25(4):325-336.

[4] 王勇,于應筠.進展期胃癌根治術后患者預后Cox分析[J].貴州醫(yī)藥,2015,9(39):813-815.

[5] Song D,Meng T,Xu W.5-Fluoruracil blocked giant cell tumor progression by suppressing osteoclastogenesis through NF-kappaB signals and blocking angiogenesis[J].Bone, 2015, 78: 46-54.

[6] Harish CP,Samriti S,Leah R.Delphinidin Reduces Cell Proliferation and Induces Apoptosis of Non-Small-Cell Lung Cancer Cells by Targeting EGFR/VEGFR2 Signaling Pathways[J].PLoS ONE,2013，8(10):e77270.

[7] Zhang G,Ye X,Ji D.Inhibition of lung tumor growth by targeting?EGFR/VEGFR-Akt/NF-κB pathways with novel theanine derivatives[J]. Oncotarget, 2014,5(18):8528-8543.

[8] Francisco A,Katja T.Simone P Niclou Therapeutic control and resistance of the EGFR-driven signaling network in glioblastoma[J].Cell Commun Signal,2015,13: 23.

[9] Unni AM，Lockwood WW，Zejnullahu K，et al.Evidence that synthetic lethality underlies the mutual exclusivity of oncogenic KRAS and EGFR mutations in lung adenocarcinoma[J].2015,4:321.

[10] Zhang Z,Ma L,Wang J .YM155 exerts a growth inhibitory effect on human osteosarcoma in vitro and in vivo[J].Oncol Rep,2015,34(2):1074-1080.

R735.2，R730.58

B

1000-744X(2016)09-0926-02

2016-04-01)

科研立項號:熱化療及基因治療對胃癌抑制、凋亡及血管生成的研究(16ZF039)

△通信作者，E-mail：173745817@qq.com