正常家兔左心室三層心肌Cx43表達的異質性研究

鐘江華，陳小盼，陸士娟，黃珊，黃康，張偉，劉正旺

(1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 海口市人民醫院心血管內科，海南 海口 570208；2.海南醫學院附屬醫院，海南 海口 570102)

·論 著·

正常家兔左心室三層心肌Cx43表達的異質性研究

鐘江華1，2，陳小盼2，陸士娟1，黃珊2，黃康1，張偉1，劉正旺2

(1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院 海口市人民醫院心血管內科，海南 海口 570208；2.海南醫學院附屬醫院，海南 海口 570102)

目的 觀察正常家兔三層心肌間跨室壁縫隙連接蛋白43(Cx43)分布的差異，探討惡性室性心律失常(MVA)的發生機制。方法檢測并對比正常家兔左心室三層心肌間的單相動作電位復極90%時程(APD90)以及Cx43蛋白(Cx43-pro)和mRNA(Cx43-Cq)的表達差異。結果(1)正常家兔三層心肌間APD90存在差別，中層心肌(233.80±19.37)組織APD90均長于心內膜(201.20±18.72)和心外膜下(202.70±19.91)心肌組織(P＜0.05)，說明家兔三層心肌間存在跨室壁復極的離散；(2)正常家兔三層心肌間的Cx43-pro[(0.58±0.08)vs(0.47±0.04)vs(0.57±0.07)]與Cx43-Cq[(24.61±2.82)vs(22.18±2.62)vs(24.43±3.31)]差異均有統計學意義(P＜0.05)，中層心肌較心內膜與心外膜下心肌組織表達減少，表明家兔三層心肌間存在跨室壁Cx43表達的異質性。結論正常家兔中層心肌與心內外膜下心肌間存在Cx43蛋白表達不均一，這是左心室存在心肌橫斷面上復極離散的蛋白基礎。

家兔；惡性室性心律失常；縫隙連接蛋白43；復極離散；中層心肌

惡性室性心律失常(MVA)是臨床常見的急危重癥，患者常常發生心臟驟停而致心源性猝死(SCD)。在低血鉀、心肌梗死、心力衰竭等病理條件下，MVA發生率明顯增加，故此探討MVA的發生機制有重要的臨床意義。近年來，有研究認為MVA的發生與跨室壁復極離散相關[1]，中層心肌的單相動作電位時程(APD)尤其是復極時程明顯較心內外膜下延長，使心肌存在跨室壁的復極離散，有誘發早期后除極(EAD)、延遲后除極(DAD)和觸發活動并在室壁橫斷面內折返形成MVA如尖端扭轉型室性心動過速、心室顫動等。但跨室壁復極離散的蛋白機制并不清楚。

縫隙連接蛋白Cx43是介導左心室肌細胞間電流傳導的主要導體[2-3]，本研究通過觀察家兔離體心臟左心室心肌單相動作電位時程(APD)和Cx43的跨室壁異質性，探討MVA的蛋白分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作 選擇健康家兔20只，體重2.0～3.0 kg，雌雄不限。

1.2 實驗中相關的溶液制備 用改良的臺氏液進行心臟離體灌流，其成分主要包：HEPES 5 mmol/L，NaH2PO41 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，NaCl 115 mmol/L，MgCl21 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，并用NaOH將制備溶液的pH值調配為7.4[4]。準備好eppendorf管，將1 mmol/L EGTA，5 mmol/L EDTA，1 mmol/L NaHCO3，1 mmol/L芐脒，1 μmol/L胃酶抑素，1 μmol/L亮肽素，1 mmol/L碘乙酰胺，100 nmol/L抑肽酶，1 mmol/L PMSF，以及pH8.0的緩沖液分別加入試管[5]。

1.3 離體心臟電生理實驗 參照既往實驗方法[4]進行電生理實驗。

1.3.1 電生理實驗前準備 將離體后的心臟放入4℃臺氏液中修剪，稱量重量后立即插管給予進行Langendorff灌流(恒壓8.52～8.78 kPa，恒溫36.5℃～37.5℃，純氧飽和)。

1.3.2 電生理實驗 起搏電極由兩支針形電極組成，兩針相距0.5 cm，在心臟搏動最強處刺入。參比電極固定于主動脈根部，將三個自制的簡易電極通過注射針頭插入左室心肌層，調整電極位置，使之分別位于心內外膜下0.5 mm處及距心外膜面距離3.0 mm處。將簡易電極全部與生物信號采集與處理系統連接，以500～1000 Hz為濾波參數。用心電生理刺激儀以1 000 ms的起搏周長固定起搏。穩定20 min后同步記錄三層心肌組織的單相動作電位。

1.4 左心室三層心肌組織提取 電生理實驗結束后剪取家兔的左心室心肌游離壁，通過快速冰凍切片的方法分別采集心內外膜下心肌和中層心肌組織(連續切片10次，每片20 μm，共200 μm)[5]。將切取的三層心肌組織放入預先準備的Eppendorf管內并液氮冷凍保存。

1.5 Western-blot檢測Cx43蛋白表達 分別將采集的家兔各層心肌組織勻漿、提取組織蛋白后根據逐個上樣，凝膠電泳后轉PVDF膜，將PVDF膜放入5% TBST脫脂牛奶中封閉2 h，滴加Cx43單克隆抗體(Zymed 35-5000)后4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記二抗(Novogene公司)后繼續室溫孵育2 h，增強化學發光法顯色后顯影于X線膠片上。獲取蛋白質信號圖像后，分別測定目的蛋白Cx43和內參蛋白GAPDH的光密度(OD)值，以兩者的比值作為Cx43蛋白的表達水平[4]。

1.6 RT-qPCR檢測Cx43 mRNA表達 將eppendorf管中各組左心室冷凍組織樣本研成粉末狀，提取心肌組織總RNA，用RevertAid First Strand反轉錄酶試劑盒合成cDNA，再行qPCR擴增，以GAPDH作為內參對比。上游引物：5′-GAGGTGGCCTTCTTGCTGAT-3′，下游引物：5′-GTTTTCTCAGTGGGGCGAGA-3′，預計擴增片段長度122 bp。GAPDH上游引物：5′-AGAGCACCAGAGGAGGACGA-3′，下游引物：5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAGG-3′，預計擴增片段長度104 bp。反轉錄反應參數：42℃60 min，70℃5 min。qPCR反應參數：50℃3 min，95℃15 min，95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，重復40個循環。qPCR擴增過程中收集熒光，反應結束后，分析、計算qPCR過程各檢測樣本熒光信號能被檢測到的循環閾值(CT值)，并通過2-ΔΔCT法計算樣本的Cx43 mRNA表達差別倍數(Cq值)以代表Cx43 mRNA相對表達水平。

1.7 檢測指標 (1)APD復極90%時程(APD90)：單相動作電位從0期復極至振幅下降90%的時間距離。(2)Cx43-pro：左心室各層心肌組織Cx43蛋白表達水平。(3)Cx43-Cq：左心室各層心肌組織Cx43 mRNA表達水平。

1.8 統計學方法 本實驗的數據資料為完全隨機設計資料，所有數據均使用SPSS13.0統計軟件進行統計分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差異的顯著性比較。如果方差齊同，組間兩兩比較采用SNK檢驗，方差不齊則用Tamhane檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 左心室三層心肌APD參數 正常家兔三層心肌間APD90存在差別，中層心肌組織APD90要長于心內膜和心外膜下心肌組織，說明家兔三層心肌間存在跨室壁復極的離散，見表1。

表1 左心室三層心肌間電生理參數和Cx43表達比較(±s，n=20)

表1 左心室三層心肌間電生理參數和Cx43表達比較(±s，n=20)

注：與心內外膜下比較，aP＜0.05；Endo：心內膜下心肌，Mid：中層心肌，Epi：心外膜下心肌。

組別Cx43-mRNA APD90Cx43-pro Endo Mid Epi 24.61±2.82 22.18±2.62a24.43±3.31 201.20±18.72 233.80±19.37a202.70±19.91 0.58±0.08 0.47±0.04a0.57±0.07

2.2 左心室三層心肌Cx43蛋白和mRNA表達比較 正常家兔左心室中層心肌的Cx43-pro與Cx43-Cq均較心內膜和心外膜下心肌組織減少(P＜0.05)，而心內膜和心外膜下心肌間無明顯差別，表明Cx43蛋白和mRNA在正常家兔左心室心肌橫斷面上的分布存在異質性，這種異質性主要是由于中層心肌Cx43表達的明顯減少所導致，見表1和圖1。

圖1 左心室三層心肌間Cx43-pro表達比較

圖2 左心室三層心肌間Cx43-Cq表達比較

3 討 論

MVA通常指持續性室性心動過速、心室撲動、心室顫動等，常常在各種器質性心臟病如心力衰竭、心肌梗死等時發生，是導致心源性猝死(SCD)的急危重心律失常。在中國每年約有數十萬人死于SCD，由于MVA的發生較為急劇，預測和治療存在很大的困難，因此深入探討其電生理和蛋白分子機制，具有重要的治療及應用價值。

先前的基礎心電生理研究已經證實，心肌不同部位的復極不均一性是MVA發生的重要機制。犬的缺血模型實驗結果已經顯示，缺血區域心肌的APD較周邊的正常心肌明顯縮短，導致心肌存在空間上的復極時程差異，這種時程長短的差別可以形成一個閉合的環形折返環[6]。病理條件下，當心肌受到損害刺激而發生電的觸發時，電信號將可以通過這個折返環在正常心肌和缺血心肌間不斷往返而發生MVA。Wu等[7]的研究進一步證實這種環形的折返途徑也可以發生于左心室壁的橫斷面上，即心內外膜下和中層心肌間。動物研究已經表明，家兔及人的中層心肌APD明顯較心內外膜下心肌延長，特別是復極2相和3相延長為主，使其容易發生早期后除極，而且APD長短的不均一必然形成心肌層橫斷面上的電流梯度，從而可以不斷折返而形成MVA。我們的結果也表明，正常家兔左心室三層心肌的APD長短并不一致，存在心室肌內的復極時程離散。

導致中層心肌跨室壁復極離散的蛋白分子機制尚未完全闡明。但是既往的實驗結果已證實，Cx43是參與MVA發生的主要蛋白分子，當左心室心肌Cx43蛋白表達減少時，心電的傳導速度也明顯變慢，表現為心電圖的QRS波增寬[8]。另外，Cx43在心肌組織的空間與數量分布上還存在差異，從而增加電生理的不穩定性[9]。因此，Cx43的表達變化是許多病理條件下心電異常的解剖基礎。我們的結果還表明，與心內外膜下心肌比較，正常家兔左心室中層心肌的Cx43表達明顯減弱(P＜0.05)，導致左心室心肌存在橫斷面上的跨室壁Cx43表達不均一，這可能是左心室心電存在跨室壁復極離散的解剖基礎。我們推測，在某些病理條件及藥物作用下，這種Cx43蛋白的表達不均一性將進一步擴大，繼而促使心電的不穩定性增加，尤其是各層心肌間復極時程的差異程度變大，進而容易誘發后除極及壁內折返而發生MVA。

[1]Abi-Gerges N,Valentin JP,Pollard CE.Dog left ventricular midmyocardial myocytes for assessment of drug-induced delayed repolarization:short-term variability and proarrhythmic potential[J].Br J Pharmacol,2010,159(1):77-92.

[2]Wen H,Jiang H,Lu Z,et al.Carvedilol ameliorates the decreases in connexin 43 and ventricular fibrillation threshold in rats with myocardial infarction[J].Tohoku J Exp Med,2009,218(2):121-127.

[3]Strom M,Wan X,Poelzing S,et al.Gap junction heterogeneity as mechanism for electrophysiologically distinct properties across the ventricular wall[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2010,298(3): H787-794.

[4]Zhong JH,Lu SJ,Chen MS,et al.Effects of hypokalemia on transmural dispersion of ventricular repolarization in left ventricular myocardium[J].Asian Pac J Trop Med,2013,6(6):485-488.

[5]Yamada KA,Kanter EM,Green KG,et al.Transmural distribution of connexins in rodent hearts[J].J Cardiovascu Electrophysiol,2004,15 (6):710-714.

[6]Antzeleritch C.Basic mechanisms of reentrant arrhythmias[J].Curropin Cardiol,2001,16(1):1-7.

[7]Wu J,Zipes DP.Transmural reentry during acute global ischemia and reperfustion in canine ventricular muscle[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,280(6):H2717-2725.

[8]Thomas SA,Schuessler RB,Berul Cl,et al.Disparate effects of deficient expression of comiexin43 on atrial and ventricular conduction: evidence for chamber-specific molecular determinants of conduction [J].Circulation,1998,97(7):686-691.

[9]Boulaksil M,WinckelsSK,Engelen MA,et al.Heterogeneous Connexin43 distribution in heart failure is associated with dispersed conduction and enhanced susceptibility to ventricular arrhythmias[J]. Eur J Heart Fail,2010,12(9):913-921.

Transmural heterogeneity of Cx43 expression in three myocardial layers of rabbit.

ZHONG Jiang-hua1,2,CHEN Xiao-pan2,LU Shi-juan1,HUANG Shan2,HUANG Kang1,ZHANG Wei1,LIU Zheng-wang2.1.Department of Cardiology, the Affiliated Haikou Hospital of Central South University Xiangya School of Medicine,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.The Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570102,Hainan,CHINA

ObjectiveTo observe the change of transmural heterogeneity of connexin 43(Cx43)protein among three myocardial layers and explore physiological mechanisms of malignant ventricular arrhythmia(MVA) in normal rabbit.Methods90%monophasic action potential repolarization duration(APD90),transmural dispersion of repolarization(TDR)and Cx43 protein(Cx43-pro)and mRNA(Cx43-Cq)expression among three myocardial layers were measured in normal rabbit.Results(1)APD90was different among three myocardial layers in normal rabbit,and APD90in the midmyocardium(233.80±19.37)was significantly prolonged than those in the subendocardium(201.20±18.72)and subepicardium(202.70±19.91)(P＜0.05),which showed that transmural dispersion of repolarization was existed among three myocardial layers.(2)Compared to those in the subendocardium and subepicardium, Cx43-pro[(0.58±0.08)vs(0.47±0.04)vs(0.57±0.07)]and Cx43-cq[(24.61±2.82)vs(22.18±2.62)vs(24.43±3.31)]expression in the midmyocardium was significantly decreased(P＜0.05),which indicated that there was transmural expression heterogeneity of Cx43 protein among three myocardial layers.ConclusionTransmural heterogeneity of Cx43 expression exists among three myocardial layers in rabbit,which may cause dispersion of repolarization.

Rabbit;Malignant ventricular arrhythmia(MVA);Cx43;Dispersion of repolarization;Midmyocardium

R-332

A

1003—6350（2016）04—0517—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.04.001

2015-10-15)

國家自然科學基金(編號：81160024)；海南省自然科學基金(編號：814371)

陸士娟。E-mail：zhong3882@163.com