SD大鼠不同小腸段對血糖控制作用的基礎研究

艾小明，楊念印，李勝春，郭紹紅，葉宜芬

(南京明基醫院普外科南京醫科大學附屬醫院，江蘇 南京 210019)

SD大鼠不同小腸段對血糖控制作用的基礎研究

艾小明，楊念印，李勝春，郭紹紅，葉宜芬

(南京明基醫院普外科南京醫科大學附屬醫院，江蘇 南京 210019)

目的 探討正常SD大鼠不同小腸段對血糖控制改變的影響和可能機制。方法將20只SD大鼠按數字表隨機分為A、B、C三組，其中A組6只，B組和C組各7只。測各大鼠體質量及尾部靜脈血空腹血糖。手術探查小腸全長度，并將其分為三等分，用7b絲線結扎每段腸管的兩端，保留正常的腸系膜血液循環。A組向近側段小腸腔內注射葡萄糖，B組向中間段小腸腔內注射葡萄糖，C組向遠側段小腸腔內注射葡萄糖（注射量均為1 mg/kg，生理鹽水稀釋至1 ml)。分別測定注射葡萄糖后2 min、15 min、45 min、75 min、120 min尾部靜脈血血糖。結果手術過程中有3只大鼠死亡，A組1只死于失血量過多，B組1只死于麻醉藥物中毒(麻醉藥物注入血管)，C組1只大鼠死于空氣栓塞，手術存活率為85%。三組SD大鼠空腹血糖相互比較差異均無統計學意義[(7.85±1.26)mmol/L vs (7.76±2.19)mmol/L vs(7.83±1.82)mmol/L,P＞0.05]。術后2 min B組與A組血糖比較差異均無統計學意義[(9.90±1.51)mmol/L vs(10.56±1.47)mmol/L,P＞0.05]；而C組[(7.78±1.56)mmol/L]明顯低于A組和B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。術后15 min、45 min、75 min、120 min血糖比較，B組均低于A組，C組均低于A組和B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論通過向不同段SD大鼠小腸注射葡萄糖的研究結果發現，近段小腸控制血糖效果最差，中間段小腸次之，遠段小腸效果最好。從本實驗的結果中可以看出，越是靠近末端的小腸，越是有控制血糖水平的能力。不同腸段對血糖控制的作用機制可能與胃腸道激素分泌有關，尚有待進一步的研究。

SD大鼠；小腸；血糖；控制

目前關于胃腸道重建手術治療2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的研究已經成為國際上研究的熱點，胃腸轉流術(GBP)對肥胖型T2DM的治療作用在國內外已經得到了廣泛證實[1-2]。盡管目前關于手術治療T2DM的機制尚未完全明確，但近端小腸(十二指腸與近端空腸)和遠端小腸(特別是末端回腸)的作用已經成為研究的熱點，由此產生了前腸學說和后腸學說這兩種學說，并且都認為小腸在T2DM的發病過程中扮演極其重要的角色[3]。既然研究一致認為GBP治療T2DM的機制-可能與手術改變了胃腸生理通道、進而影響到食物生理流向有關，那么理論上，在這一過程中整個小腸的任何部位的腸段都有可能是參與血糖調控的關鍵部位。本研究選用正常SD大鼠作為研究對象，旨在探討大鼠不同小腸段在注入葡萄糖后血糖的動態變化，進而推測其調節血糖的機理，并為進一步進行糖尿病大鼠模型的動物實驗研究奠定下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要材料 SPF級6周齡的SD大鼠20只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，雌雄各半，體重130～160 g。OneTouch?SelectSimple?血糖儀(美國強生公司)。AEL-200型電子分析天平(日本LIBROR公司)。丙泊酚(意大利阿斯利康制藥有限公司)，氯胺酮(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)，50%葡萄糖、生理鹽水(中國大冢制藥有限公司)。實驗動物基礎飼料(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。基礎飼料適應性喂養1周，飲用直飲水。手術器械由南京明基醫院實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 將20只SD大鼠分為三組，其中A組6只，B組及C組各7只，雌雄隨意分配。

1.2.2 術前準備 手術前禁食12 h、不限飲水。分別測各組大鼠體質量及尾部靜脈血空腹血糖。

1.2.3 分段結扎腸管 以丙泊酚(100 mg/kg)+氯胺酮(50 mg/kg)腹腔內注射麻醉。麻醉成功后大鼠取仰臥位，常規0.5%碘伏消毒后取上腹部正中切口，長約4 cm。進腹后探查全小腸長度，并將其均分為三等分，并用7b絲線靠近腸壁結扎每段腸管的兩端，保證腸腔內注射的液體不會流出注射段腸腔，保留正常的腸系膜血液循環。

1.2.4 腸腔注射葡萄糖 向小腸腔內注射葡萄糖液體：注射量：1 mg/kg(用50%的葡萄糖配置，生理鹽水稀釋至1 ml)。A組向近側段小腸腔內注射，B組向中間段小腸腔內注射，C組向遠側段小腸腔內注射。

1.2.5 測定血糖 分別測定各組大鼠注射葡萄糖后2 min、15 min、45 min、75 min、120 min尾部靜脈血血糖。最后將全部大鼠按脊椎脫臼法處死。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件包對數據進行分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 手術成功率及大鼠存活情況 手術過程中有3只大鼠死亡，A組1只死于失血量過多，B組1只死于麻醉藥物中毒(麻醉藥物注入血管)，C組1只大鼠死于空氣栓塞，手術存活率為85%。

2.2 三組大鼠血糖值變化 三組SD大鼠手術前后血糖水平變化見表1和圖1。三組SD大鼠空腹血糖相互比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。術后2 min B組與A組血糖比較差異均無統計學意義(P＞0.05)；而C組明顯低于A組和B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。術后15 min、45 min、75 min、120 min血糖比較，B組均低于A組，C組均低于A組和B組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表1 SD大鼠手術前后血糖水平變化(±s，mmol/L)

表1 SD大鼠手術前后血糖水平變化(±s，mmol/L)

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05。

組別 鼠數（只） 空腹手術后(min) A組B組C組5 6 6 7.85±1.26 7.76±2.19 7.83±1.82 2 10.56±1.47 9.90±1.51 7.87±1.58ab15 16.65±2.46 12.46±2.48a8.88±2.04ab45 17.42±0.84 13.43±2.67a9.93±1.16ab75 18.53±3.07 15.43±2.34a9.97±2.31ab120 21.28±4.12 17.98±6.20a10.38±4.13ab

圖1 SD大鼠手術前后血糖水平變化

3 討 論

T2DM的發病機制是由于體內胰島素激素相對不足，或周圍組織對胰島素敏感性下降而引起的血糖升高。傳統的糖尿病治療方法，主要包括飲食控制、運動、口服降糖藥物、胰島素治療等，但傳統手段并不能保證使患者血糖恢復正常，也不能避免糖尿病所致的各種嚴重并發癥及病情的進一步加重，長期會加重患者的經濟負擔、降低生活質量。GBP從20世紀80年代開始應用于合并肥胖癥的T2DM患者，開辟了T2DM治療的一個新的領域，已成為胃腸外科研究的熱點。Müller-stich等[4]研究發現，GBP不僅使T2DM患者的血糖水平降低，而且使肥胖癥和糖耐量受損患者得以改善、避免其進展為T2DM，同時還使T2DM患者的并發癥發生率和病死率降低。在美國2009年糖尿病防治指南中，已經明確將GBP手術列入治療2型糖尿病標準[5]。中華醫學會糖尿病學分會及中華醫學會外科學分會也在2011年對手術治療糖尿病達成專家共識[1]。由此可見，共識與聲明已經明確了“糖尿病外科治療”的重要意義。

T2DM外科手術治療的機制目前尚不完全明確，可能與手術通過消化道重建對胃腸道激素分泌的影響，以及由此產生的胰島素分泌或敏感性的改變相關[6]。科學家們已開始將術后降低血糖的機制轉向了胃腸道激素的作用[7]。GBP術后，食物的消化部位從原來的十二指腸、近端空腸直接轉移到了遠端空腸和回腸，使腸道激素的分泌發生了改變。關于GBP治療T2DM的機制，形成了多種假設和學說，但絕大多數都是在消化道改道和重建的基礎上提出來的。大多數的學者認為，在胃腸道的黏膜上廣泛分布有大量的內分泌細胞、并分泌各種胃腸道激素，GBP術后胃腸道激素的改變，被認為是GBP治療T2DM的最主要機制[8]。GBP術后，食物自小胃囊直接排入遠端小腸，未經過充分消化的食糜過早的到達末段回腸。腸道在營養物質特別是各種碳水化合物的刺激下，通過釋放多種內分泌激素和遞質來促使胰島素的分泌和釋放，且腸道攝取葡萄糖所產生的B細胞分泌胰島素的反應、會比靜脈注射葡萄糖能產生更高的效果，這種胃腸道激素與胰島素分泌之間的關系、也就是胃腸道與胰腺內分泌之間的關系，被稱之為“腸-胰島軸(Enteroinsular axis)”。Rubino等[9]設想，人的腸道中可能存在分泌腸促胰島素(Incretin)和抗-腸促胰島素(Anti-incretin)的部位，且這二部位同時存在。Anti-incretin的分泌部位主要分布在十二指腸與近段空腸，它的分泌能對抗胰島素活性、產生胰島素抵抗，而并不是直接抑制胰島素的分泌和合成[10]。GBP術后食物繞過了十二指腸和近段空腸，避免了對Anti-incretin分泌部位的刺激。這一機制通過減少十二指腸與近段空腸分泌Anti-incretin(如抑胃肽)，減少對胰島素合成和分泌的抑制，增強胰島素的敏感性，就形成了前腸學說(Foregut hypothesis)。再者，也可能由于未充分消化的食物過早地到達末段回腸，這一機制通過刺激、誘導末段回腸分泌和合成Incretin(如胰高血糖素樣肽-l)，促進胰島素的合成和分泌，增強外周組織對胰島素的敏感性，達到使血糖下降、甚至恢復正常的作用，就形成了后腸學說(Hindgut hypothesis)。研究證明，外科手術(如GBP)是可以治愈糖尿病的，所以有學者認為，2型糖尿病可能就是一種小腸外科的疾病[3，11]。

從本研究中可以看出，總體上B組對血糖控制效果優于A組，而C組對血糖控制效果不僅優于A組，而且優于B組。本實驗研究說明，從血糖上升速度和程度方面來看，近段小腸控制效果最差，中間段小腸次之，遠段小腸效果最好。中段小腸與遠段小腸在注射葡萄糖120 min時，血糖最高值也沒能到達近端小腸的數值。末段小腸注射葡萄糖后，血糖上升緩慢，且不超過11 mmol/L。從本實驗的結果中可以看出，越是靠近末端的小腸，越是有控制血糖水平的能力。雖然腸道吸收功能的差異有可能是這種現象的原因，但是吸收功能的差異，不能很好解釋為什么實驗終點120 min時，血糖水平仍有差異。所以我們推測這些差異更可能與胃腸道激素分泌的影響密切相關。這項實驗的結果可以作為轉流手術能夠有效治療Ⅱ型糖尿病的理論基礎之一。也就是行GBP術后，食物不經過近段、中段小腸，食物僅僅通過末段小腸，其結果就能控制血糖上升的速度與高限。

與糖尿病有關的胃腸道激素，目前研究較多、較深入的主要有腸抑胃肽(Gastric inhibitory peptide，GIP，又稱葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽)、胰高血糖素樣肽-l(Glucagon-like peptide 1，GLP-1)等。GIP由十二指腸和近端空腸腸壁上之K細胞受食物中的脂肪、碳水化合物刺激后所分泌[12]，是43個氨基酸所組成的直鏈肽，屬于胰泌素和胰高血糖素家族。一般生理狀態下，當血液中的血糖≥6.0 mmol/L時，GIP能刺激胰島素的合成和分泌，能抑制胃的蠕動和排空；而在T2DM的病理狀態下，由于體內存在異常活化的腸-胰島軸，能使GIP水平增高，體內會產生過多的胰島素，繼而就產生了胰島素抵抗。而GBP術后食物繞過了近端小腸，減少了對十二指腸和近端空腸腸壁上的K細胞刺激，GIP的釋放也相應大大減少，解除了胰島素的抵抗，從而T2DM得以獲得治愈。Flatt[6]通過研究顯示，GBP術后近端小腸釋放的GIP減少。

研究顯示，GLP-1可能是腸-胰島軸中控制T2DM最重要的作用靶點和最核心的介導因子[13]。GLP-1是由胰高血糖素原基因表達，由回腸末端及結腸腸壁上的L細胞分泌的多肽鏈序列，是人體內的一種腸源性激素。進食后，食物進入腸腔后能直接刺激GLP-1的釋放[14]。GLP-1的分泌也可能受到胃腸道內分泌和神經機制等的調控。GLP-1的主要作用表現在以下幾個方面：①通過腺苷酸環化酶作用于胰島B細胞，促進胰島素基因的轉錄，增加葡萄糖濃度依賴性的胰島素的合成和分泌，減少餐后血糖的波動。研究顯示，體內持續性低劑量注射GLP-1，可以促使胰島B細胞對葡萄糖的反應恢復到正常水平[15]；②通過誘導胰島B細胞增殖與分化，抑制胰島B細胞的凋亡，增加胰島B細胞數量；③既可以葡萄糖濃度依賴性地作用于胰島B細胞、促進胰島素的分泌，還可以作用于胰島A細胞、強烈抑制胰高血糖素的分泌[16]；④具有保護胰島B細胞的作用，改善胰島B細胞功能，從而減輕胰島素抵抗；⑤餐后引起GLP-1的分泌，還可作用于中樞神經系統(特別是下丘腦)，從而使人體產生飽脹感和食欲下降，起到了終止攝食信號的作用。GLP-1通過降低食欲，有助于減輕體重[17]；⑥能延遲胃排空，進而減緩食物消化，降低餐后血糖。目前已有實驗證明在GBP術后胰島素的分泌增加和GLP-1水平升高相關[18]。有大量研究顯示，GBP術后的餐后GLP-1分泌水平明顯上升[19]。

構成“腸-胰島軸”的成員，除了胰島素、GIP、GLP-1外，還包括胃饑餓素(Ghrelin)、人多肽YY (Peptide YY，PYY)、縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)、瘦素(Leptin)、脂聯素(Adiponectin/ADPN)以及胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor 1，IGF-1)等。此外，多種炎癥介質，包括腫瘤壞死因-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和C-反應蛋白(CRP)等，亦可能參與了血糖調控、胰島素抵抗[20]，在糖尿病的發病過程中起到了重要作用。近年來已有學者提出糖尿病可能屬于炎癥性疾病。研究表明GBP術后患者IL-6、CRP、TNF-α水平均有不同程度的降低，脂肪組織內的巨噬細胞浸潤減少，胰島素抵抗得以改善[21]。總之，其調控過程是極其錯綜復雜的。

本實驗的缺陷是：(1)選擇的大鼠不是糖尿病大鼠；(2)是動物實驗；(3)沒有對大鼠血液中胃腸道激素的變化及胰島素的變化進行測定。所以目前還不能直接將本實驗結果推斷成人體的實際情況。這些都是我們今后需要進一步研究的內容，以期為外科手術治療T2DM提供更多的基礎理論支持。

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Effect of different segments of small intestine on blood glucose control in Sprague-Dawley rats.

AI Xiao-ming, YANG Nian-yin,LI Sheng-chun,GUO Shao-hong,YE Yi-fen.Department of General Surgery,BenQ Medical Center,the Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210019,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo evaluate the effect and possible mechanisms of different segments of small intestine on blood glucose control in Sprague-Dawley(SD)rats.MethodsTwenty SD rats were randomly divided into three groups based on a random number table:group A(n=6),group B(n=7),and group C(n=7).The body weight and the values of fasting plasma glucose(FPG)were measured.All the rats underwent an operation,and the whole length of small intestine was separated into three segments averagely(proximal,middle,and distal segment),with each segment ligated at the ends by 7b silk suture.In group A,B,C,50%glucose(at the dose of 1 mg/kg,adding normal saline to 1 ml)was injected into enteric cavity of proximal segment,middle segment,distal segment,respectively.The values of blood glucose were tested at 2 min,15 min,45 min,75 min and 120 min after operation.ResultsThree rats died during the operation, with one in group A died of excessive blood loss,one in group B of toxicity of local anesthetics,and one in group C of air embolism.The survival rate of the operation for the rats was 85%.There were no significant differences in the values of FPG among the three groups[(7.85±1.26)mmol/L vs(7.76±2.19)mmol/L vs(7.83±1.82)mmol/L,P＞0.05].At 2 min after operation,the values of blood glucose showed no significant differences between group A and B[(9.90±1.51)mmol/L vs (10.56±1.47)mmol/L,P＞0.05],but the values of group C[(7.78±1.56)mmol/L]were significantly lower than those of group A and group B(P＜0.05).Furthermore,at 15 min,45 min,75 min,120 min after operation,values of blood glucose of group B were significantly lower than those of group A,and the values of group C were significantly lower than those of group A and group B(P＜0.05).ConclusionEffect of proximal segment of small intestine on blood glucose control was the worst after injection of glucose,followed by middle segment,and the effect of distal segment was the best, which indicates that the more close to distal small intestine,the better effect could be achieved on blood glucose control. The possible mechanisms of different segments of small intestine on blood glucose control in SD rats may be associated with gastrointestinal hormone secretion.

Sprague-Dawley(SD)rat;Small intestine;Blood glucose;Control

R-332

A

1003—6350（2016）04—0520—04

2015-10-09)