海南地區不孕人群HBV感染對體外受精-胚胎移植結局的影響

周立花，符免艾，李娟

(海南省農墾總醫院生殖科，海南 海口 570311）

海南地區不孕人群HBV感染對體外受精-胚胎移植結局的影響

周立花，符免艾，李娟

(海南省農墾總醫院生殖科，海南 海口 570311）

目的 了解海南地區不孕人群HBV的感染率，探討男方或女方HBV感染對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)結局的影響。方法回顧性分析2009年1月至2014年12月在我院生殖科行IVF-ET助孕治療的1 192對夫婦共1 192個周期的資料，統計男性HBsAg(+)與女性HBsAg(+)例數，了解HBV的感染率。從1 192個周期中選取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123個周期為男性HBV感染組、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83個周期為女性HBV感染組，隨機選擇男女雙方均HBsAg(-)165個周期為對照組。分別比較男性HBV感染組、女性HBV感染組與對照組的精子質量、受精率、優質胚胎率、種植率和臨床妊娠率等各項指標之間的差異性。結果1 192對夫婦個周期中HBV感染率為15.98%(381/2 384)。男性HBV感染組與對照組比較精子質量差異無統計學意義(P＞0.05)，2pn受精率低于對照組(56.8%vs 60.8%)，但移植日子宮內膜厚度厚于對照組[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm]，臨床妊娠率高于對照組(41.5%vs 30.0%)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。女性HBV感染組與對照組相比兩組的種植率[24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]、臨床妊娠率(37.5%vs 30.0%)等指標比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論海南地區不孕人群HBV的感染率偏高，但無論是男方還是女方感染HBV均未影響IVF助孕結局。

海南地區；乙型肝炎；精子質量；體外受精-胚胎移植

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個全球性的公共健康問題。據世界衛生組織統計，全世界約20億人感染過乙肝病毒，其中約3.5億為慢性感染，而中國屬于HBV感染的高流行地區[1]。HBV雖然是嗜肝病毒，也可感染肝外其他組織，如女性的卵巢[2-3]和男性的睪丸、附睪中均能發現HBV-DNA[4]。因此，乙型肝炎病毒可能通過配子直接傳給后代，也有可能影響精子和卵子質量，從而影響體外受精胚胎移植(IVF-ET)助孕結局。本文通過統計本院生殖科HBV的感染率，大致了解HBV感染在海南不孕人群中的發病率，并且通過與正常人群對比了解HBV感染是否影響體外受精胚胎移植助孕結局。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2014年12月在我院生殖科就診進行IVF-ET治療的夫婦1 192對，共1 192個新鮮周期資料，男女雙方均行HBsAg檢測。選擇以長方案或改良超長方案促排卵的周期，并排除女方患多囊卵巢綜合征(PCOS)、子宮內膜異位癥或夫婦雙方有支原體、衣原體感染。根據以上標準從1 192個周期中選取男性HBsAg(+)女性HBsAg(-)123個周期為男性HBV感染組、女性HBsAg(+)男性HBsAg(-)83個周期為女性HBV感染組，隨機選擇男女雙方均HBsAg(-)165個周期為對照組。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵方案 (1)常規長方案：上一次月經黃體中期開始應用長效促性腺激素釋放激素類似物(達菲林)降調節。(2)改良超長方案：在第一次降調同常規長方案，28 d再次予長效達菲林降調一次。達到降調節標準后[卵泡刺激素(FSH)≤5 mlU/mL，促黃體生成素(LH)≤5 mIU/mL，雌二醇≤50 pg/mL，內膜≤5 mm，卵泡直徑≤5 mm]，應用促性腺激素進行促排卵。按B超檢測結果和血漿內分泌激素水平調整促性腺激素(Gn)的用量。當1個卵泡平均直徑＞18 mm、或3個卵泡平均直徑＞17 mm、或4個卵泡直徑＞16 mm時給予人絨毛膜促性腺激素(hCG)注射，36～37 h取卵。

1.2.2 精液處理 采用世界衛生組織推薦的相關標準，對精液進行精液常規分析及采用精子形態快速染色法，對精子染色后于顯微鏡下進行嚴格的形態學檢查；采用密度梯度離心法進行精液洗滌，并經過上游處理。根據精子質量、既往妊娠史，不孕年限等因素綜合考慮，選擇行IVF、IVF+ICSI或直接ICSI受精。

1.2.3 胚胎體外培養 胚胎卵裂期評分標準根據取卵后胚胎形態和碎片多少，將胚胎分為4級。標準如下：Ⅰ級，細胞大小均勻，形態規則，透明帶完整，胞質清晰，無顆粒現象，碎片＜5%卵裂球面積；Ⅱ級，細胞大小略不均，形態略不規則，胞質可有顆粒現象，碎片10%～20%；Ⅲ級，細胞大小明顯不均，可有明顯的形態不規則，胞質可有顆粒現象，碎片21%～50%；Ⅵ級，細胞大小嚴重不均，胞質可有嚴重的顆粒現象，碎片＞50%。若胚胎發育速度過慢或過快，即第2天＜3個卵裂球或≥6細胞，第3天＜6細胞或≥10細胞，則卵裂期胚胎評分降級。我們將取卵后第3天卵裂球數目超過6和碎片小于20%的胚胎認為是優質胚胎[5]。

1.3 統計學方法 應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，兩樣本計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數資料用率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV感染率 1 192個周期中男性HBsAg (+)223人，女性HBsAg(+)158人，夫婦雙方均HBsAg (+)68人(34對)，HBV總感染率為15.98%[(223+158)/ 2 384)]。其中男性HBV感染率為18.71%(223/1 192)，女性為13.26%(158/1 192)。

2.2 男性HBV感染對IVF-ET影響 男性HBV感染組與對照組比較，雙方年齡，不孕年限、女方體質量指數(BMI)、原發或繼發不孕等因素比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向運動精子比和正常精子比率兩組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，兩組Gn用量、獲卵數、受精方式、優胚率、種植率比較差異也均無統計學意義(P＞0.05)。對照組2pn受精率高于HBV感染組(56.8%vs 60.8%，P= 0.019)，但是男性HBV感染組移植日子宮內膜厚度大于對照組[(12.06±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm，P= 0.002)，臨床妊娠率高于對照組(41.5%vs 30.0%，P= 0.012)，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 女性HBV感染對IVF-ET的影響 女性HBV感染組與對照組比較，雙方年齡，不孕年限、BMI，原發或繼發不孕等因素比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，男方精液量、精子密度、前向運動精子比和正常精子比率兩組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。兩組在Gn用量、獲卵數、受精方式、2pn受精率、優胚率、種植率、移植日子宮內膜厚度和臨床妊娠率等方面比較差異也均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表1 男性HBV感染組與對照組各項指標比較(±s)

表1 男性HBV感染組與對照組各項指標比較(±s)

基本情況女方年齡(歲)男方年齡(歲)不孕年限(年)原發:繼發BMI精液量精子密度前向運動精子比精子正形率(%) Gn用量ET日內膜厚度(mm)獲卵數2pn受精率(%)優胚率(%)臨床妊娠率(%)種植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI男方HBsAg(+) 33.09±4.67 35.89±5.25 5.49±3.59 42:81 21.22±2.43 2.24±0.82 77.32±53.03 48.21±17.65 8.06±4.77 2486.18±678.23 12.06±2.956 11.13±6.09 56.8 38.1 41.5(51/123) 32.4(66/204)對照組33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1(89/296) t值/χ2值-1.41 -1.48 1.161 0.645 -1.782 -0.109 0.952 1.659 0.974 -0.007 3.057 -0.405 5.495 1.97 6.386 0.295 2.093 P值0.160 0.140 0.247 0.422 0.085 0.914 0.342 0.098 0.331 0.994 0.002 0.686 0.019 0.160 0.012 0.587 0.351 62 35 23 76 43 43

表2 女性HBV感染組與對照組各項指標比較(±s)

表2 女性HBV感染組與對照組各項指標比較(±s)

基本情況 女方HBsAg(+)對照組女方年齡(歲)男方年齡(歲)不孕年限(年)原發:繼發34.21±4.89 37.19±6.18 5.63±4.04 26:57 33.88±4.72 36.88±5.94 5.01±3.33 49:115 t值/χ2值P BMI精液量精子密度前向運動精子比精子正形率(%) Gn用量21.32±2.48 2.21±0.55 87.54±63.55 44.52±18.50 8.79±5.73 2490.66±753.11 21.75±2.64 2.25±0.74 71.65±47.45 44.73±17.56 7.51±4.27 2486.74±649.11 0.507 0.716 1.275 0.055 -1.232 -0.588 2.192 0.241 1.91 0.042 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0值ET日內膜厚度(mm)獲卵數2pn受精率(%)優胚率(%)臨床妊娠率(%)種植率(%)受精方式IVF ICSI IVF+ICSI 11.41±3.11 10.99±5.95 59(538/912) 38.1(190/538) 37.5(30/80) 24.2%(38/157) 11.06±2.29 11.42±6.10 60.8 35.0 30(45/150) 30.1%(89/296) 0.963 -0.536 0.885 0.020 1.335 1.748 2.332 .613 .716 .203 .815 .219 .557 .029 .810 .057 .966 0.337 0.592 0.347 0.887 0.248 0.186 0.312 44 24 15 76 43 43

3 討 論

在我院生殖科行IVF-ET助孕的夫婦需常規檢測是否有乙肝病毒攜帶，據我們的資料統計，IVF就診夫婦中HBV感染率為15.98%[(223+158)/2 384]，遠高于我國1992年流行病學調查所顯示的1～59歲人群HBV感染率9.8%[6]。其中男性HBV感染率為18.7%(223/1 192)，也高于國內其他學者所報道的ART中男性HBV的感染率，如費前進等[7]報道的1 208對ART夫婦中男方HBV感染率為13.9%，武新梅等[8]報道的溫州地區1 268對ART夫婦男方HBV感染率為15.1%。這可能與海南地區生活習慣、經濟狀況和人口流動較大相關。

通過檢查HBV感染男性患者的睪丸和附睪組織，發現不同發育階段的生精細胞和支持細胞均能檢測到HBV-DNA[4]。用HBV感染精子行人精子去透明帶金黃地鼠卵穿透試驗獲得精子染色體，發現染色體異常顯著增加，而且還表現出僵硬、轉曲和不易上色的特點[9]。因此推測HBV感染除了可能將HBV病毒通過精子直接傳染給后代外，還能影響精子質量。但是我們通過對比男性HBV感染組與對照組的精液量，精子密度、前向精子比率和正常精子比率，兩組之間均無統計學差異。這個結果不同于有些研究者的報道，他們的研究結果顯示HBV感染會使精子的密度減少、活力偏低和畸形率升高[10-11]。HBV導致精子質量異常的可能機制是：乙肝病毒作用于精子前的各級生精細胞，導致生精細胞調亡的增加，可誘導精子凋亡通路中的早期變化的發生，導致細胞膜完整性受損和通透性增加[12]。還可以整合到精子DNA，導致精子染色體的不穩定，誘導基因突變，造成精子DNA損傷和染色體異常[13]。

隨著不孕不育人群的增多，乙肝患者夫婦求助輔助生殖技術的人數也在不斷的增加。但HBV感染對是否對輔助生殖技術助孕結果有影響，目前存在很大的爭議。HBV可以進入男性精子，整合進入人的基因組[14]。攜帶有乙肝病毒的精子可以穿過透明帶，進入卵母細胞的細胞質，受精后，在胚胎的早卵裂期就表達HBV的mRNA和蛋白[15]。HBV感染的女性在卵子和胚胎中也能檢測出HBV-DNA[16-17]。研究報道HBV的感染會降低IVF/ICSI的受精率、胚胎種植率和妊娠率[18-19]，并會提高妊娠早期流產率[20-21]，甚至還有報道認為女性HBV感染與分娩時孕周相關[22]。相反，Lee等[23]發現盡管男性HBV陽性患者的精子正常形態率顯著降低，但行IVF治療的臨床種植率和妊娠率無顯著降低，用HBV感染的男性精子與供卵結合后，與對照組比較，受精率和臨床妊娠率也差異無統計學意義[24]。還有研究認為HBV感染組有更高的種植率(43.3%vs 18.4%，P＜0.01)和繼續妊娠率(53.3%vs 24.2%，P＜0.01)[21]。本研究中，男性HBV感染組精子質量與對照組比較差異無統計學意義，說明HBV感染未影響到精子質量。雖然男性HBV感染組2pn受精率低于對照組，但妊娠率高于對照組(41.5%vs 30.0%，P＜0.05)，差異有統計學意義，這可能與移植日子宮內膜厚度大于對照組有關(12.06±2.95 vs 11.06±2.29)，而是否與乙肝感染關系不明確。我們的研究能證明男性HBV感染不會降低IVF-ET的臨床妊娠率。而女性乙肝組的2pn受精率，種植率和妊娠率與對照組比較差異無統計學意義。雖然目前有很多關于HBV感染對輔助生殖技術結局影響的研究報道，但是是否有影響仍有爭議，影響的機制仍不明確。由于樣本量和研究人群的不同，HBV感染程度不同，以及精子和卵子和胚胎的修復作用，各個研究者給予的結論也不完全相同。

我們研究顯示，海南地區不孕人群HBV感染率偏高。無論男方還是女方HBV感染，均未影響體外受精輔助生殖技術的結局，HBV感染的患者同正常人群一樣，可以通過輔助生殖技術幫助解決生育問題。

[1]王雄.383名孕婦產前HBV感染現況分析[J].海南醫學,2012,23 (20):112-113.

[2]余敏敏,顧小軍,夏茵,等.人卵巢組織中HBV DNA和HBV cccDNA的表達與HBV宮內感染的相關性研究[J].中華流行病學雜志, 2013,34(2):178-182.

[3]梅順利,黃錦,劉平,等.乙型肝炎攜帶者卵巢顆粒細胞中HBV DNA的檢測[J].中華醫學雜志,2010,90(25):1778-1780.

[4]Sun PN,Zheng TH,She GZ,et al.Expression pattern of asialoglycoprotein receptor in human testis[J].Cell Tissue Res,2013,352(3): 761-768.

[5]Balaban B,Urman B,Isiklar A,et al.The effect of pronuclear morphology on embryo quality parameters and blastocyst transfer outcome[J].Oxford Journals Medicine&Health Human Reproduction, 16,11:2357-2361.

[6]Liang XF,Bi SL,Yang WZ,et al.Evaluation of the impact of hepatitis B vaccination among children born during 1992-2005 in China[J]. Hepatitis B Vaccination among Children,2009,200(1 July):39-47.

[7]費前進,黃學鋒,楊海燕.男性乙肝攜帶者行卵胞漿內單精子注射和常規體外受精治療后的胚胎結局[J].中國男科學雜志,2008,22 (1):36-38.

[8]武新梅,謝奇鵬,葉松道,等.溫州地區1268對行IVF/ICSI治療夫婦HBV感染狀況分析[J].中國衛生檢驗雜志,2011,21(11): 2739-2741.

[9]Huang JM,Huang TH,Qiu HY,et al.Effects of hepatitis B virus infection on human sperm chromosomes[J].World J Gastroenterol, 2003,9(4):736-40.

[10]吳娟子,劉佳,朱桂金,慢性乙肝患者的精液結果分析[J].中國優生與遺傳雜志,2008,16(11):102-103.

[11]Zhou XP,Hu XL,Zhu YM,et al.Comparison of semen quality and outcome of assisted reproductive techniques in Chinese men with and without hepatitis B[J].Asian Journal of Andrology,2011,13(3): 465-469.

[12]Huang JH,ZhongY,Fang XW,et al.Hepatitis B virus S protein enhances sperm apoptosis and reduces sperm fertilizing capacity in vitro[J].PLoS One,2013,8(7):e68688.

[13]Kang XJ,Xie QD,Zhou XL,et al.Effects of hepatitis B virus S protein exposure on sperm membrane integrity and functions[J].PLoS One,2012,7(3):e33471.

[14]Huang JM,Huang TH,Qiu HY,et al.Studies on the integration of hepatitis B virus DNA sequence in human sperm chromosomes[J]. Asian JAndrol,2002,4(3):209-212.

[15]Ali BA,Huang TH,Salem HH,et al.Ex?pression of hepatitis B virus genes in early em?bryonic cells originated from hamster ova and human spermatozoa transfected with the complete viral genome[J]. Asian JAndrol,2006,8(3):273-279.

[16]Nie R,Jin L,Zhang H,et al.Presence of hepatitis B virus in oocytes and embryos:a risk of hepatitis B virus transmis?sion during in vitro fertilization[J].Fertil Steril,2011,95(5):1667-1671.

[17]Hu XL,Zhou XP,Qian YL,et al.The presence and expression of the hepatitis B virus in human oocytes and embryos[J].Hum Reprod, 2011,26(7):1860-1867.

[18]Shi L,Liu S,Zhao W,et al.Hepatitis B virus infection reduces fertilization ability during in vitro fertilization and embryo transfer[J].J Med Virol,2014,86(7):1099-1104.

[19]Pirwany IR,Phillips S,Kelly S,et al.Reproductive performance of couples dis?cordant for hepatitis B and C following IVF treatment [J].JAssist Reprod Genet,2004,21(5):157-161.

[20]Ye F,Liu Y,Jin Y,Shi J,et al.The effect of hepa?titis B virus infected embryos on pregnancy outcome[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,172:10-14.

[21]Lam PM,Suen SH,Lao TT,et al.Hepatitis B infection and outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer treatment[J].Fertil Steril, 2010,93(2):480-485.

[22]Lin SL,Li R,Zheng XY,et al.Impact of hepatitis B virus carrier serostatus on neonatal outcomes after IVF-ET[J].Int J Clin Exp Med, 2015,8(4):6206-6211.

[23]Lee V,Ng E,Yeung W,et al.Impact of positive hepatitis B surface antigen on the outcome of IVF treatment[J].Reproductive BioMedicine Online,2010,21(5):712-717.

[24]Bu ZQ,Kong HJ,Li J,et al.Effect of male hepatitis B virus infection on outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer treatment:insights from couples undergoing oocyte donation[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(7):1860-1866.

Impact of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer in Hainnan province.

ZHOU Li-hua,FU Mian-ai,LI Juan.Department of Reproduction,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311, Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the prevalence of hepatitis B virus(HBV)infection in the infertile couples in Hainan province,and to analyze the effect of HBV infection on the outcomes of in vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET).MethodsA retrospective analysis was performed on 1 192 couples receiving IVF-ET(1 192 cycles) form January 2009 to December 2014 in Hainan Provincial Nongken General Hospital.The number of males and females with HBsAg(+)was recorded,and the prevalence of HBV infection was examined.One hundred and twenty-three cycles of male HBsAg(+)and female HBsAg(-)were selected as male HBV infected group,and 83 cycles of female HBsAg(+)and male HBsAg(-)were selected as female HBV infected group,with 165 cycles of male HBsAg(-)and female HBsAg(-)as the control group.Sperm quality,fertilization rate,high-quality embryo rate,implantation rate,and clinical pregnancy rate were compared between male HBV infected group and control group,female HBV infected group and control group.ResultsThe HBV infection rate was 15.98%(381/2 384)in the 1 192 couples.Male HBV infected group and control group had no statistically significant difference in sperm quality(P＞0.05),but the two groups showed statistically significant difference in 2pn fertilization rate(56.8%vs 60.8%),endometrial thickness on the day ofembryos transferred[(12.01±2.95)mm vs(11.06±2.29)mm],and the clinical pregnancy rate(41.5%vs 30.0%),P＜0.05. Female HBV infected group and the control group showed no statistically significant difference in implantation rate [24.2%(66/204)vs 30.1%(45/150)]and clinical pregnancy rate(37.5%vs 30.0%),P＞0.05.ConclusionThe HBV infection rate of the infertile patients was relatively high in Hainan province,but neither the man nor the woman infected with HBV exerted any effect on the outcomes of IVF-ET.

Hainan province;Hepatitis B;Sperm quality;In vitro fertilization and embryo transfer(IVF-ET)

R512.6+2

A

1003—6350（2016）07—1044—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.07.005

2015-11-02)

海南省衛生廳科研項目（編號：13A200036）

李娟。E-mail：hainanjuanli@163.com