結核菌實驗室診斷研究進展

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·綜述·

結核菌實驗室診斷研究進展

吳敏 綜述， 張麗霞 審校

(天津市海河醫院檢驗科，天津 300350)

關鍵詞:診斷；微生物學；免疫學；結核

結核病是世界范圍內發病率和病死率較高的一種疾病。據世界衛生組織2013年的調查研究數據表明，2012年估計全球結核病發病率總體上從南非的1 000/10萬至美國和歐洲部分地區、日本、澳大利亞和新西蘭等的10/10萬。當年共發生結核病病例860萬，其中13%(110萬)是HIV陽性病例，大約75%的新發病例出現在非洲地區。2012年世界范圍內的結核病病例主要集中在東南亞(29%)，非洲(27%)和西太平洋(19%)地區，印度和中國的結核病病例占病例總數的26%和12%。大多數結核病患者和死亡病例發生在男性人群，但該病仍是女性前三名的死因之一。在2012年，全球共有45萬病例發展為耐多藥結核病，因此死亡的患者達到17萬人[1]。

在臨床實踐中快速發現個體是否感染結核比較困難[2]，只有44%的新發病例(兒童中是15%～20%[3])可以通過痰標本的快速抗酸染色陽性發現[1]。結核病診斷的金標準是標本中發現結核分枝桿菌。事實上，最終診斷依據也是在人的樣本中通過微生物培養方法檢測到結核分枝桿菌。盡管如此，平均需要花費至少2周或者數周的時間才能夠培養出結核分枝桿菌。針對于一些臨床上結核病的患者，痰抗酸染色陰性話無法早期使用抗結核治療。臨床上關于活動性結核病的診斷分類往往依據于不同的檢測方法：包括結核菌素實驗，胸部放射學檢查，結核分枝桿菌核酸檢測和(或)生物樣本病理學檢查。在這篇文章中研究者綜述了一些近期發展的針對于患者活動性肺結核早期快速診斷的一些方法。

1傳統微生物學檢查

由于新的診斷技術發展不斷，已經取得了全球性可喜效果。盡管如此，結核患者的診斷仍舊主要依賴痰涂片和痰培養，影像學檢查和臨床癥狀，并且全球57%的結核患者采用了細菌學診斷方法。因此，仍有必要盡力改善現存方法的診斷質量。并且也已經取得了一些進展。

1.1顯微鏡痰涂片檢查傳統顯微鏡檢查的一大進展就是熒光顯微鏡的出現，相比傳統的光學顯微鏡來說，檢測的敏感度大大提高，特異度也不差[4]。熒光顯微鏡在資源較富裕國家已經普遍運用，效果遠優于普通的光學顯微鏡。

為了提高痰涂片的敏感度，需要做3次檢測，但是現在這個原則受到懷疑，認為第3次的效果較前兩次的結果并沒有很明顯的有效，至少在質控較好的實驗室是這樣的[5]。如果一個患者不能分泌痰，必須采取一些方法使患者分泌痰。這些方法的應用，大大提高了醫療資源缺乏國家痰涂片的陽性率，因為對于他們來說，獲取支氣管灌洗液較困難。

1.2培養方法的進展從20世紀90年代以來，發明了很多方法，利用液體培養基培養的方法來快速檢測結核分枝桿菌。有文獻表明，利用液體培養基培養的方法的敏感度比固體培養基高[6]。培養的平均時間，BACTEC MGIT960是12.9 d，BACTEC 460是15.0 d，Lowenstein Jensen固體培養基是27.0 d。因此，世界衛生組織推薦在資源缺乏的國家采用液體培養基的方法檢測結核分枝桿菌和進行藥敏試驗[7]。一些新的診斷方法，利用分枝細菌噬菌體僅需要2.0 d或是更短的時間即可檢測結核分枝桿菌，具有較高的特異度(83%～100%)，但是敏感度不高(21%～88%)，和傳統的培養方法相比[8]。噬菌體檢測的方法也用于快速檢測結核分枝桿菌利福平耐藥性。盡管如此，這些分析方法的診斷準確性對于臨床標本的直接運用是不足的。

仍然有其他的依據表型分析的儀器研發，主要運用于藥物敏感性檢測。有一種儀器是顯微鏡觀察藥物敏感性，利用倒置顯微鏡觀察結核分枝桿菌在孔內液體培養基中的生長形態。另外一種設備是，細菌生長時，通過培養基顏色的改變，同時也有一些其他的顏色指示劑運用于檢測結核分枝桿菌多耐藥分析。這些DST方法可以運用于臨床痰標本，并且具有較好的應用性，同遺傳學方法相比，敏感度和特異度較高，平均時間是21.0～23.0 d[9]。

2微生物分子生物學診斷方法

2.1核酸擴增技術(NAAT)結核分枝桿菌特異性NAAT檢測肺支氣管樣本是實驗室常用的用于診斷肺結核的分子學方法。NAAT結果在獲取痰標本或是支氣管灌洗液標本1.0 d之內得出，并且匯報給臨床醫生，對于患者病情診療具有很大的意義。不幸的是，NAAT擴增的靶序列沒有標準化，診斷的準確性高度不均一。NAAT應用于臨床樣本肺結核診斷的臨床價值的meta分析表明[10]痰標本抗酸染色陽性的患者來說，NAAT方法的敏感度高于95%。NAAT檢測陰性的結果可以提示該患者沒有結核分枝桿菌感染。相反的，抗酸染色陰性結果的患者，NAAT關于活動性肺結核診斷的敏感度高度不均一，并且不持續，準確性不夠作為日常推薦診斷結核。一般來說，巢式NAAT方法，以IS61 10作為靶序列，具有較高的診斷準確性。

一個患者的痰涂片結果為陰性的話，早期meta分析認為NAAT法診斷活動性肺結核的特異度是97%，而近期的研究[10]表明該方法的特異度為98%。結核分枝桿菌特異的NAAT法的陽性結果可以高度提示肺結核。盡管如此，遠遠少于50%的患者具有痰結核菌涂片陰性，而痰標本或是灌洗液標本NAAT檢測陽性，有結核病病史的患者和支氣管肉瘤的患者易出現假陽性的結果。

2.2線性探針分析線性探針分析是一種檢測抗菌藥物耐藥性分析常見基因突變。簡單地說，這個檢測包括DNA提取，核酸擴增，固相反雜交在膜，檢測耐藥性突變。The Genotype MTBD Rplus分析檢測許多基因突變，包括rpoB，katG基因和inhA基因啟動子區域[11]。通過meta分析，利福平敏感度在臨床樣本中和傳統DST培養一致。同時可以檢測其他基因突變，包括那些喹諾酮類和可注射的藥物,如阿米卡星或是卡那霉素。

3免疫學診斷

3.1抗原抗體檢測進展利用血清學檢測來診斷結核已經有較長的歷史，因此，這種檢測方法的改進特別需要。由于要在少菌階段，包括成年人肺結核痰涂片陰性和肺外結核，兒童結核和共感染HIV的結核患者，早期診斷疾病的方法必須操作簡便、快速，并且診斷的敏感度和特異度較高。有些時候，這些方法也用于檢測近期結核感染、監測結核病治療的進展。盡管如此，與其他急性細菌和病毒感染的患者相比，運用血清學反應診斷結核具有更多阻礙，包括活動性疾病和先天性感染之間的區別；一個具有廣泛空洞性損害的患者疾病不活動；微小的疾??；和與非結核分枝桿菌感染的區別。

近來，Steingart等[12]對該項技術進行meta分析，作者指出在痰涂片陰性的患者總結出沒有一種抗原的敏感度高的足夠可以代替顯微鏡痰涂片鏡檢，因此必須進行相關的研究，發現新的抗原。與此同時，新技術的質量也需要改進，包括有好的研究設計和好的效果指示劑設計敏感度和特異度，建立結核患者樣本庫。因此，現在有的血清學檢測不推薦作為結核診斷的方法。

3.2細胞免疫診斷的進展結核菌素皮試(TST)和干擾素γ釋放分析(IGRA)分別在體內和體外檢測了持續性結核特異性T細胞反應性。它們是結核既往感染和現行感染的直接指示標志。TST和IGRA單獨在外周血中起作用，因此不能區分隱性結核感染、活動性結核和既往結核感染[13]。

3.3TSTTST是由澳大利亞科學家發明的，作為一種檢測兒童結核中的一種變應原測試。自20世紀初以來，它被認為是結核免疫診斷的金標準。盡管近代出現了IGRA技術，TST仍然應用很廣泛，作為一種篩查方法，鑒定患者對結核分枝桿菌的一種陽性免疫反應。

一個標準的純化蛋白制備，結核分枝桿菌培養物上清的滅菌提取物，產生延遲超敏反應通過局部皮膚注射。為了檢測結果的可靠性，TST在人的反應是通過腫塊的直徑大小來反應，在皮下注射純蛋白衍生物(PPD)后48～72 h觀察結果。最近的meta分析[14]指出TST檢測活動性結核的敏感度是77%，盡管如此，這項測試的敏感度可能被急劇降低，例如在新生兒和一些老年人；具有獲得性免疫缺陷的患者(如HIV感染的患者)；接受糖皮質激素治療的患者；接受免疫抑制劑治療的患者；患有急性腎衰的患者；營養不良的患者及腫瘤患者。TST測試的特異度主要是依賴于BCG疫苗的狀態和測試個體的免疫反應狀態?？乖慕徊娣磻栽诒┞队贜TM[15]或是注射BCG疫苗以后可能導致TST測試陽性結果。TST誘導反應超過15 mm的話，一般提示結核或是早期結核感染。近來，有皮膚測試一期臨床實驗利用重組早期分泌抗原靶標-6(ESAT-6)代替結核菌素安全性高[16]，培養濾過蛋白(CFP)-10抗原結合可以提高診斷的敏感度。

3.4IGRAIGRA是ESAT-6和CFP-10抗原的耦合，這兩種是結核分枝桿菌相對特異度較高的。主要包括兩種商業系統，QuantiFERON-Gold (QFT-G)測量干擾素-γ單位為IU/mL，利用酶聯免疫放射分析；以及T-SPOT.TB計數釋放干擾素γ的細胞，可見通過酶聯免疫印記(ELISPOT)。總結不同國家研究表明[14，17]，IGRA最初是用于診斷隱性結核感染，但不是結核感染診斷的金標準，IGRA的特異度一直很高，并且顯然優于TST，然而敏感度在不同的研究中是相當不同的。這些可變性可以歸咎于患者在不同結核病時期、年齡、劃線的疾病下的免疫狀態的特異度不同等。盡管如此，IGRA的敏感度還是高于TST。比較QFT-G和 T-SPOT.TB，T-SPOT.TB的敏感度高于QFT-G[14]。

4結核病狀態和診斷的其他生物標志

4.1熒光激活細胞分選通過熒光激活細胞分選技術分選支氣管細胞或是痰細胞進行抗原刺激的免疫分型，可以快速診斷痰涂片陰性的結核患者。然而多色流式細胞儀分析可以更好的分選細胞樣本，在結核隱性感染的患者中，支氣管細胞和痰T細胞被富集為PPD特異的淋巴細胞，并且流式細胞儀分析經過PPD刺激后不能區分活動性結核和隱性結核感染。盡管如此，如果需要的話，流式細胞儀分析法是推薦作為精確診斷痰抗酸染色陰性結核患者的局部免疫診斷分析方法[18]。

4.2結核診斷的其他可能方法作為結構和功能蛋白的科學，蛋白組學已經鑒定蛋白標志物為診斷或是預后的標志物，或者是作為一些疾病治療的靶標，包括結核病。Agranoff等[19]運用這種方法來分析血清蛋白指紋，或者是個體蛋白質文庫，來鑒別個體是否感染結核。它的診斷有效性的敏感度(93.5%)和特異度(94.9%)都較高。

除了血清學診斷，脂質體被考慮作為一種激活的尿標志物在一種抗原捕獲ELISA分析系統中運用于診斷結核。依據一種商業試劑盒評價，這種脂質體ELISA的敏感度很低[20]，但是有研究表明這種敏感度在HIV陽性的研究對象中有所提高[21]，因此推薦在HIV感染的患者中該方法同痰涂片檢查聯合使用。

5結論

診斷和治療很好的結合是控制結核病的最基本的元素，并且也會持續很久，直到出現新的疫苗或是可以有效防止結核病進展的藥物，在20世紀中時代，結核病的治療取得了革命性的進展，出現了一系列化療的方法，然而在診斷方面卻沒有什么太大的進展變化。盡管如此，結核病控制不是可能的，如果活動性疾病患者的診斷被延遲的話，就會導致很多其他與之接觸的人受到傳染。另外，錯誤的陰性感染陽性診斷也會導致個體不必要的負擔和醫療機構的負擔。新的診斷技術的出現是急需的。據本文中總結的結核診斷相關技術，應該制訂出針對不同的情況運用相應的技術，只有這樣才能使患者和治療機構很好的結合，更好地做到結核病控制。

參考文獻

[1]Harris JB,Gacic-Dobo M,Eggers R,et al.Global routine vaccination coverage,2013[J].MMWR,2014,63(46):1055-1058.

[2]Pai M,O′Brien R.New diagnostics for latent and active tuber-culosis:state of the art and future prospects[J].Semin Respir Crit Care Med,2008,29(5):560-568.

[3]Arora J,Sidiq Z,Sharma S,et al.Phylogenetic associations with drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in a paediatric population[J].Int J Tuberc Lung Dis,2014,18(10):1172-1179.

[4]Davis JL,Cattamanchi A,Cuevas LE,et al.See comment in PubMed Commons below Diagnostic accuracy of same-day microscopy versus standard microscopy for pulmonary tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J].Lancet Infect Dis,2013,13(2):147-154.

[5]Tuberculosis Coalition for Technical Assistance.International Standards for Tuberculosis Care (ISTC)[S].Tuberculosis Coalition for Technical Assistance,The Hague,2006.

[6]Coban AY,Deveci A,Sunter AT,et al.Nitrate reductase assay for rapid detection of isoniazid,rifampin,ethambutol,and streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis:a systematic review and meta-analysis[J].J Clin Microbiol，2014,52(1):15-19.

[7]Torrea G,Coeck N,Desmaretz C,et al.Bedaquiline susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in an automated liquid culture system[J].J Antimicrob Chemother，2015,70(8):2300-2305.

[8]Kalantri S,Pai M,Pascopella L,et al.Bacteriophage-based tests for the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens:a systematic review and meta-analysis[J].BMC Infect Dis,2005,5(1):59.

[9]Bwanga F,Hoffner S,Haile M,et al.Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis:a meta-analysis[J].BMC Infect Dis,2009,9(1):67.

[10]Jafari C,Thijsen S,Sotgiu G,et al.Bronchoalveolar lavage enzyme-linked immunospot for a rapid diagnosis of tuberculosis:a TBNET study[J].Am J Respir Crit Care Med,2009,180(7):666-673.

[11]Maschmann Rde A,Sá Spies F,Nunes Lde S,et al.Performance of the GenoType MTBDR plus assay directly on sputum specimens from Brazilian patients with tuberculosis treatment failure or relapse[J].J Clin Microbiol,2013,51(5):1606-1608.

[12]Steingart KR,Dendukuri N,Henry M,et al.Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis:a meta-analysis[J].Clin.Vaccine Immunol,2009,16(1):260-276.

[13]Lange C,Pai M,Drobniewski F,et al.Interferon-gamma release assays for the diagnosis of active tuberculosis:sensible or silly?[J].Eur Respir J,2009,33(6):1250-1253.

[14]Pai M,Zwerling A,Menzies D.Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection:an update[J].Ann Intern Med,2008,149 (3):177-184.

[15]Farhat M,Greenaway C,Pai M,et al.False-positive tuberculin skin tests:what is the absolute effect of BCG and non-tuberculous mycobacteria?[J] Int J Tuberc Lung Dis,2006,10(11):1192-1204.

[16]Bergstedt W,Tingskov PN,Thierry-Carstensen B.First-in-man open clinical trial of a combined rdESAT-6 and rCFP-10 tuberculosis specific skin test reagent[J].PLoS One,2010,5(6):11277.

[17]Mori T.Usefulness of interferon-gamma release assays for diagnosing TB infection and problems with these assays[J].J Infect Chemother,2009,15(3):143-155.

[18]Nemeth J,Winkler HM,Zwick RH,et al.Recruitment of Mycobacterium tuberculosis specific CD4+ T cells to the site of infection for diagnosis of active tuberculosis[J].J Intern Med,2009,265(1):163-168.

[19]Agranoff D,Fernandez-Reyes D,Papadopoulos MC,et al.Identification of diagnostic markers for tuberculosis by proteomic fingerprinting of serum[J].Lancet,2006,368(9540):1012-1021.

[20]Daley P,Michael JS,Hmar P,et al.Blinded evaluation of commercial urinary lipoarabinomannan for active tuberculosis:a pilot study[J].Int J Tuberc Lung Dis,2009,13(8):989-995.

[21]Shah M,Variava E,Holmes CB,et al.Diagnostic accuracy of a urine lipoarabinomannan test for tuberculosis in hospitalized patients in a high HIV prevalence setting[J].J Acquir Immune Defic Syndr,2009,52(2):145-151.

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.037

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0519-03

作者簡介：吳敏，女，主管技師，主要從事微生物分子生物學研究。