shAkt2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)H292細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

蔣莉　劉丹　李為民　陳渤江

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科, 四川 成都 610041)

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shAkt2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)H292細(xì)胞增殖和凋亡的影響*

蔣莉1,2劉丹2李為民2陳渤江2

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院呼吸科, 四川 南充 637000)；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸科, 四川 成都 610041)

【摘要】目的構(gòu)建shAk2基因慢病毒表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定干擾Akt2基因的細(xì)胞克隆，建立靶向沉默Akt2的非小細(xì)胞肺癌穩(wěn)定細(xì)胞株，并探討Akt2基因在非小細(xì)胞肺癌中的作用。 方法根據(jù)shRNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Akt2靶基因的雙鏈寡核苷酸序列，經(jīng)退火、酶切、連接反應(yīng)，將干擾序列插入pLKD.CMV.GFP.U6質(zhì)粒，經(jīng)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、陽性克隆測(cè)序鑒定所插入的片段，抽提重組質(zhì)粒及輔助包裝元件載體質(zhì)粒p-Helper1.0和p-Helper2.0，通過陽離子脂質(zhì)體lipofectemin2000介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及慢病毒包裝，收集濃縮病毒進(jìn)行滴度測(cè)定，感染至人肺腺癌細(xì)胞H292，通過無菌流式細(xì)胞分選GFP強(qiáng)陽性細(xì)胞，應(yīng)用Western-blot驗(yàn)證干擾效果。CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V．FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果與正常對(duì)照組比較，shAkt2組細(xì)胞中Akt2蛋白水平減少90.89%，提示靶向抑制Akt2的慢病毒shRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功，并獲得穩(wěn)定抑制Akt2基因表達(dá)的細(xì)胞克隆。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，shAkt2組細(xì)胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明顯減低(P<0.05)，干擾Akt2基因表達(dá)后顯著抑制細(xì)胞增殖速率。采用Annexin-V/7-AAD流式細(xì)胞分析法檢測(cè)各組中凋亡細(xì)胞的比例，shAkt2組凋亡率顯著高于NC及NSCLC組(P<0.05)。 結(jié)論靶向干擾Akt2基因表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞株H292細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)其凋亡。

【關(guān)鍵詞】非小細(xì)胞肺癌; Akt2 慢病毒載體; 細(xì)胞增殖; 凋亡

Construction of a recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2 and it’s effects on proliferation and apoptosis in H292 cell linesJIANG Li1,2, LIU Dan2, LI Weimin2,etal

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchongCentralHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofNorthSichuan

MedicalUniversity,Nanchong637000,Sichuan,China;

2.DepartmentofRespiratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo construct the lentivirus shRNA vector targeting Akt2 and observe the biological behaviors of NSCLC cell lines after Akt2 knockdown and intensify the downstream regulation mechanisms in NSCLC. MethodsSequences for targeting the Akt2 gene was selected. The double strand shRNA oligo was ligated to pLKD.CMV.GFP.U6 lentivirus vector. The construct was verified by sequencing. The viral particles were collected and infected NSCLC cells. After selection of GFP positive cells by FACS, protein expression levels of Akt2 were determined by Western blot. The study was divided into 3 groups, including shAkt2 cells, negative control (NC) and NSCLC normal control groups. Cells were characterized in vitro using proliferation assay and apoptosis analysis. ResultsshAkt2 stable transfected cells were purified by FACS with GFP marker. The ratio of selection was 90%-95%. Efficacy of Akt2 knockdown was determined by western blot. Our data showed that protein expression level of Akt2 was inhibited by 90% compared with control groups, and Stable knockdown of Akt2 in NSCLC cells was successfully established. Knockdown of Akt2 in NSCLC cells significantly inhibited cell proliferation and promoted cell apoptosis in H292 cell lines (allP<0.05). ConclusionShAkt2 could significantly inhibit the Akt2 expression levels in H292 cell lines. Akt2 plays a pivotal role in NSCLC cell differentiation, growth. These results supply new potential therapeutic target for NSCLC intervention.

【Key words】Lung carcinoma； RNA interference； Lentiviral vector； Cell proliferation

Akt是人類染色體基因組中鼠類胸腺淋巴瘤病毒(T-8 strain from AKR/J mouse, Akt8)致癌基因(v-Akt)的同源物，因其蛋白質(zhì)產(chǎn)物是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與蛋白激酶A、C高度同源，又被命名為蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)[1]。共有Akt1、Akt2、Akt3 3種亞型，分別調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)行為。Akt2是Akt的重要亞型，以磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)依賴的方式激活，能磷酸化一系列下游蛋白，通過多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡[2，3]。細(xì)胞凋亡在腫瘤的進(jìn)展和耐藥中都起到了重要作用，Akt可通過調(diào)節(jié)下游的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化水平參與細(xì)胞凋亡途徑。研究發(fā)現(xiàn)Akt2在肺癌組織中表達(dá)增高并與預(yù)后相關(guān)[4]，但其介導(dǎo)的特異性信號(hào)通路尚未闡述清楚。本研究通過靶向沉默Akt2基因的慢病毒表達(dá)載體技術(shù)，探討Akt2對(duì)肺腺癌細(xì)胞株H292細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡的影響。

1材料和方法

1.1材料人肺癌細(xì)胞株H292及人胚腎293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；慢病毒載體及包裝系統(tǒng)載體pLOV.ubc.eGFP購(gòu)于紐恩(上海)生物科技有限公司；Enhanced infection solution(ENI．S)、polybrene、含無義序列的shRNA及綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記對(duì)照慢病毒載體、小干擾序列和引物購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司；2000DMEM、FBS購(gòu)于hyclone；primer(R&F)、Trizol、Lipofectamine、positive clone 測(cè)序及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；BamHI、EcoRI等限制性內(nèi)切酶購(gòu)于New England Biolabs；SYBR TAQ Real-time試劑盒購(gòu)于Bio-Rad公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)于Qiagen公司；Cell Counting kit-8 (CCK-8) Dojindo公司；V-APC/7AAD、蛋白抽提試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技公司，BCA protein assay kit購(gòu)于Pierce公司；兔抗人AKT2抗體、Western 抗兔二抗購(gòu)于 Cell Signaling Technology；Luminata Western HRP substrate、PVDF膜購(gòu)于Millipore公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于Fermentas公司。

1.2方法

1.2.1ShAKT2慢病毒載體的構(gòu)建利用NCBI查找Akt2基因的mRNA序列(NM_001626, 5263 bp mRNA linear)，根據(jù)RNA干擾設(shè)計(jì)序列原則及既往文獻(xiàn)報(bào)道，采用Invitrogen公司BLOCK-iT在線設(shè)計(jì)并進(jìn)行評(píng)估測(cè)定，選擇最佳動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)于紐恩公司合成含干擾序列的dsDNA oligo。經(jīng)分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，據(jù)其對(duì)Akt2的抑制率，確定有效靶序列為5′-CCGGGCACAGGTTCTTCCTCAGCT TCAAGAGAGCTGAGGAAGAACCTGTGCTTTT TTg -3′,5′-AATTCAAAAAAGCACAGGTTCTTC CTCAGCTCTCTTGAAGCTGAGGAAGAACCTGT GC -3′。含無義序列的shRNA慢病毒載體作為對(duì)照。合成靶片段退火后形成雙鏈DNA，與經(jīng)Age I和EcoR I雙酶切后的pGCSIL-PUR載體相連，轉(zhuǎn)化DH5ct大腸桿菌。挑取重組陽性克隆行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及送測(cè)序鑒定。PCR鑒定引物根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，Primer(+)：5′-CCTATTTCCCATG ATTCCTTCATA -3′Primer(-)：5′-GTAATACGG TTATCCACGCG-3′。

1.2.2慢病毒重組體的包裝取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度1.2×107細(xì)胞/20ml，接種于15cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后細(xì)胞密度約70~80%時(shí)加pLKD.CMV.GFP.U6質(zhì)粒、質(zhì)粒(psPAX2 質(zhì)粒和pMD2.G 質(zhì)粒進(jìn)行感染。48 h后收集病毒上清液，于4℃4000×g離心10 min，再用直徑為0.46 μm的PVDF濾膜過濾后，上清分裝，用于病毒滴度測(cè)定和細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組正常對(duì)照組(H292組)，為未感染慢病毒載體的H292細(xì)胞。陰性對(duì)照組(NC組)，為陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組(shAkt2組)，穩(wěn)定干擾Akt2的NSCLC細(xì)胞克隆。

1.2.4.細(xì)胞培養(yǎng)、病毒轉(zhuǎn)染和克隆篩選①細(xì)胞培養(yǎng)及病毒感染，H292細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2，的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，以5×104/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12~24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)30%，加入108TU/ml病毒150ul (MOI：75)轉(zhuǎn)染，以GFP標(biāo)記的慢病毒相同條件同時(shí)感染細(xì)胞觀察感染效率。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基。感染后72 h，分別行熒光定量PCR和Western blot免疫印跡檢測(cè)SLC35F2表達(dá)水平。②克隆篩選，流式細(xì)胞分選成功感染shAkt2細(xì)胞同時(shí)表達(dá)報(bào)告基因GFP蛋白，以GFP為標(biāo)記獲得高純度穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shAkt2的細(xì)胞克隆。

1.2.5Western blot免疫印跡根據(jù)凱基生物蛋白抽提試劑盒操作說明抽提細(xì)胞蛋白。經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V恒定電壓轉(zhuǎn)膜，封閉過夜，Akt2一抗工作濃度1∶1000，二抗工作濃度1∶5000，β-actin一抗工作濃度1∶10 000，二抗工作濃度1∶10000。采用Millipore公司Luminata Crescendo Western HRP substrate顯色液孵育3min，放入暗盒(感光時(shí)間根據(jù)熒光條帶的強(qiáng)弱來判定)曝光，取出X光片，放入自動(dòng)洗片機(jī)顯影定影后用柯達(dá)掃描儀將條帶掃描至電腦保存。Quantity one分析軟件測(cè)定條帶灰度。

1.2.6CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的3組細(xì)胞計(jì)數(shù)并鋪板于96孔板上(2×103/孔)，每組3復(fù)孔。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~4d，每24h測(cè)量一次細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。測(cè)量前，向檢測(cè)孔加入10μl CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡用不含EDTA的胰酶消化收集3組細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次(2000rpm離心5min)收集1～5×105細(xì)胞。加入500μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μL Annexin V-APC混勻后，加入5 μL 7-AAD染液，混勻。室溫、避光、反應(yīng)5～15min。在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)633nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)660 nm，Annexin V-APC的紅色熒光使用FL4通道檢測(cè)；激發(fā)波長(zhǎng)Ex=546 nm；發(fā)射波長(zhǎng)Em=647 nm，7-AAD紅色熒光使用FL3通道檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1Akt2-ShRNA慢病毒載體的鑒定挑選的陽性克隆行PCR鑒定，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為343 bp，未連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為：306 bp，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符(見圖1)。經(jīng)兩次獨(dú)立測(cè)序證實(shí)合成的Akt2-ShRNA寡核苷酸鏈和陰性對(duì)照序列插入正確。

圖1pGCsil-shAkt2-GFP質(zhì)粒菌落PCR電泳圖

Fig 1PCR electrophoresis of pGCsil-shAkt2-GFP plasmid colony

注：1.空載體對(duì)照組；2.Marker；3，7， 9，10，11，12.陽性克??；8.測(cè)序

挑選重組質(zhì)粒陽性克隆送至Invitrogen公司測(cè)序。結(jié)果顯示：陽性克隆序列內(nèi)含有干擾Akt2的shRNA片段序列，片段序列為：CcggGCACAGGTT CTTCCTCAGCTTCAAGAGAGCTGAGGAAGAA CCTGTGCTTTTTg，片段大小為57bp，與之前所設(shè)計(jì)的針對(duì)Akt2的shRNA片段序列完全符合。證明shAkt2序列已成功克隆到慢病毒pLKD.CMV.GFP.U6載體中，見圖2。

圖2重組pGCsil-shAkt2-GFP質(zhì)粒測(cè)序鑒定

Fig 2Sequencing and identification of recombinant pGCsil-shAkt2-GFP plasmid

2.2RNAi對(duì)肺癌細(xì)胞H292Akt2基因表達(dá)的抑制作用GFP標(biāo)記的病毒對(duì)照轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h即可見較強(qiáng)熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染14 d后，仍見強(qiáng)GFP熒光表達(dá)(見圖3)。說明慢病毒載體高效、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率。Western blot結(jié)果同樣顯示，Akt2蛋白表達(dá)明顯受到抑制。隨后我們使用流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)1個(gè)月后得到穩(wěn)定克隆，再次進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明Akt2的表達(dá)明顯減少。

采用逐孔稀釋法測(cè)定病毒滴度，如圖3a為shAkt2慢病毒載體，圖3b為空載病毒載體。從上至下依次為病毒原液經(jīng)倍比稀釋感染293T細(xì)胞后，明視野及熒光視野下觀察細(xì)胞GFP表達(dá)情況。熒光細(xì)胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)的增加而減少，所加病毒體積為10E1μl(10μl),10E0μl(1μl),10E-1μl(0.1μl)。

流式分選，培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)3天后分別在明視野、熒光視野下觀察細(xì)胞GFP熒光表達(dá)水平，病毒感染效率大于90%(見圖4)。Western blot分析三組細(xì)胞Akt2蛋白表達(dá)水平； 定量檢測(cè)各組蛋白條帶灰度值， 均以內(nèi)參條帶灰度為參照物，比較各組Akt2蛋白表達(dá)水平，與H292及NC組比較，P<0.05，見圖5。

2.3Akt2對(duì)肺癌細(xì)胞H1299增殖的影響CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(見圖6)，結(jié)果表明Ak2穩(wěn)定抑制后對(duì)細(xì)胞增殖的影響呈時(shí)間依賴性。與對(duì)照組比較，shAkt2組細(xì)胞在48h，72h，96h及120h的吸光度值明顯減低(P<0.05)，干擾Akt2基因表達(dá)后顯著抑制細(xì)胞增殖速率。

圖3重組shAkt2慢病毒滴度測(cè)定

Fig 3Titer determination of recombinant RNA interference lentiviral vector targeting Akt2

圖4流式分選后各組細(xì)胞病毒感染率及GFP熒光表達(dá)水平

Fig 4Lentiviral infection rate and GFP fluorescence expression level of each group after fluorescence-activated cell sorting

圖5H292、NC及shAkt2組細(xì)胞Akt2蛋白表達(dá)水平的比較

Fig 5The Akt2 protein expression detected with Western blot Assay

2.4干擾Akt2表達(dá)對(duì)NSCLC 細(xì)胞凋亡的影響H292細(xì)胞株shAkt2組凋亡率顯著高于NC及NSCLC組(P<0.05)，而NC與NSCLC組相比，凋亡細(xì)胞比例基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明下調(diào)Akt2蛋白表達(dá)顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡，慢病毒表達(dá)載體對(duì)細(xì)胞凋亡無影響，見圖7。

圖6各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Fig 6Growth curves of cells

注：與H292、NC組比較均①P<0.05

3討論

Akt2基因是Akt家族的重要亞型，已證實(shí)其激活后能磷酸化其下游多種底物，通過多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及化療耐藥中發(fā)揮重要作用[5-9]。慢病毒shRNA(小發(fā)夾RNA, short hairpin RNA)表達(dá)載體介導(dǎo)RNA干擾因其能夠感染廣泛的宿主細(xì)胞，穩(wěn)定整合于靶細(xì)胞的基因組內(nèi)，具有表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、靶向性佳，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，而成為基因治療和基因功能研究的重要工具[10,11]。

莆等研究發(fā)現(xiàn)Akt2在NSCLC組織中過表達(dá)，且磷酸化Akt2表達(dá)陽性患者生存時(shí)間明顯短于表達(dá)陰性患者[4]。Miao 等[12]發(fā)現(xiàn)，Akt2的表達(dá)與NSCLC無病生存率和總的生存率相關(guān)，而與臨床病理學(xué)嚴(yán)重程度不相關(guān)；Balsara等[13]對(duì)肺癌病人的病理組織進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Akt2的過度活化對(duì)癌細(xì)胞局部浸潤(rùn)發(fā)揮作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，Akt2可以促進(jìn)肺癌的粘膜下侵蝕和氣道內(nèi)生長(zhǎng)。Myoung等[14]應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制NSCLC細(xì)胞株Akt1、Akt2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抑制上述基因表達(dá)能增加NSCLC對(duì)順鉑治療的敏感性。提示Akt2可能參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展，Akt2有望作為非小細(xì)胞肺癌早期診斷和基因治療的理想靶點(diǎn)。本研究中采用了腺癌細(xì)胞株H292，并發(fā)現(xiàn)，抑制Akt2蛋白表達(dá)能顯著抑制H292細(xì)胞株的增殖，說明在NSCLC中，Akt2是細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的重要調(diào)控因子。Lisa等[15]在對(duì)正常小鼠肌細(xì)胞及人成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Akt2主要參與調(diào)控細(xì)胞周期，對(duì)細(xì)胞增殖無作用。這與我們的結(jié)果不一致，我們推測(cè)，在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中，Akt2調(diào)控細(xì)胞存活的方式不同。

為進(jìn)一步研究Akt2影響H292細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的途徑，我們采用流式細(xì)胞分析抑制Akt2基因表達(dá)后細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Akt2基因的表達(dá)， H292細(xì)胞的凋亡率顯著增加。我們推測(cè)，Akt2對(duì)細(xì)胞凋亡的作用是調(diào)控細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)。Yan等下調(diào)Akt2后神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的凋亡顯著增強(qiáng)[16]，這與我們的研究結(jié)果一致。

本研究表明，Akt2參與了調(diào)控H292細(xì)胞增殖和凋亡。但現(xiàn)有的研究沒有闡明Akt2在NSCLC體內(nèi)的作用及機(jī)制，且Akt2及其信號(hào)通路是怎樣調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡尚不清楚。因此，Akt2有望成為NSCLC靶向治療的候選靶點(diǎn)，但尚需要更深入地進(jìn)行體內(nèi)和體外研究。

圖7流式細(xì)胞分析各組細(xì)胞凋亡的水平

Fig 7Effects on apoptosis of each group detected with FACS

注：與H292及NC組比較①P<0.05

4結(jié)論

本研究方法獲得穩(wěn)定干擾Akt2基因表達(dá)的NSCLC細(xì)胞克隆。在NSCLC中，靶向干擾Akt2基因表達(dá)抑制NSCLC細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

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(收稿日期：2015-09-06； 編輯： 陳舟貴)

通訊作者：李為民，教授，本刊副主編。E-mail：weimi003@yahoo.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81372504)；四川省衛(wèi)計(jì)委重點(diǎn)學(xué)科科研課題(150092)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)培育項(xiàng)目(CBYI3-A-ZP23)

【中圖分類號(hào)】R 373

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.01.006