HPLC法測定新疆脹果甘草全草中甘草查爾酮A的含量

西力扎提·阿不來提，楊旭超，木合布力·阿布力孜，任丙昭(新疆醫科大學藥學院藥物化學有機教研室，烏魯木齊　830011)

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HPLC法測定新疆脹果甘草全草中甘草查爾酮A的含量

西力扎提·阿不來提，楊旭超，木合布力·阿布力孜*，任丙昭(新疆醫科大學藥學院藥物化學有機教研室，烏魯木齊830011)

摘要：目的對新疆脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)全草中甘草查爾酮A(Lico A)進行含量測定。方法用HPLC法對脹果甘草根、莖和葉中Lico A的含量進行測定。色譜柱：依利特 Hypersil ODS2 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)配預柱；流動相：甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；流速:1.0 mL·min-1;柱溫：25 ℃;檢測波長：372 nm。結果Lico A質量濃度在6.937 5~111 μg·mL-1范圍內線性關系良好(r=0.999 9)；平均加樣回收率99.6%，RSD=1.5%；按此法測得的Lico A含量在根中為0.468%，莖中為0.254%，而在葉中未檢出。結論甘草查爾酮A在甘草中主要分布在根和莖中，莖也可作為獲取Lico A的新資源。

關鍵詞：新疆脹果甘草；甘草全草；甘草查爾酮A；高效液相色譜

甘草是豆科植物中的多年生草本植物之一，在我國被廣泛應用和開發有4 000多年的歷史，被記錄在許多國家的藥典中，包括美國[1]、日本[2]和其他國家[3]。在我國傳統醫學中至少70%的處方都含有甘草。《中國藥典》(2015年版一部)記載其原屬植物包括2種，即脹果甘草(GlycyrrhizainflataBat)和光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)，其中脹果甘草在新疆地區資源分布較為多見[4]。甘草查爾酮A(Lico A)是一種含氧的查爾酮，也是脹果甘草的特異性成分之一，Lico A被認為是治療寄生蟲、 瘧疾和利什曼病[5-7]的潛在候選藥物[8]。Lico A具有抗炎、抗氧化、抗免疫力及抗腫瘤作用[9]，具有比較良好的抗癌活性，諸多研究表明， Lico A顯示出較為明顯的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并且能夠有效地抑制癌細胞在機體內的擴散及轉移[10-13]。這些研究結果表明，甘草中的查爾酮類單體Lico A在抗癌創新藥物的研究中具有潛在的深入研究價值。然而，Lico A在脹果甘草中的含量很低，人工合成方法的工藝路線復雜，制備成本很高[14-15]。這促使人們去尋找Lico A的新資源和新來源。我國學者崔永明等[14]早已建立了Lico A的HPLC含量測定方法，本文運用了此方法對脹果甘草全草各部位中Lico A的含量進行分析，并根據結果探討脹果甘草全草的綜合開發利用思路。

1儀器與試藥

1.1儀器LC-20AB泵，N-1001型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；AB104-N電子天平(Mettler-Toledo Group)；高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測器(日本島津公司)；DT200型電子分析天平(常熟市衡器廠)；SK2510HP型數控超聲清洗儀(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2試藥新疆脹果甘草(2014年8月分別采集自南疆地區的各個甘草基地，如新疆巴楚、新和、和田)，用薄層方法鑒定為脹果甘草[16]。甲醇為色譜純；水為屈臣氏純凈水；Lico A對照品(美國Sigma公司，批號803529)質量分數≥99%；無水乙醇、甲醇和冰醋酸均為分析純；蒸餾水為自制。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱:Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)配預柱；流動相：甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)；檢測波長：372 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃。

2.2Lico A對照品溶液的制備稱取干燥恒質量的Lico A對照品(120 ℃)11.1 mg，精密稱量，置于10 mL量瓶中，用體積分數為60%的甲醇溶液溶解配制成質量濃度為1.11 mg·mL-1的溶液；從上述配液中精密吸取2 mL，置于10 mL量瓶中，用體積分數為60%的甲醇溶液溶解，配制成質量濃度為0.222 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備分別稱取已粉碎好的甘草莖、根、葉20 g(過60目篩)，置于250 mL圓底燒瓶中，加入甲醇溶液150 mL， 超聲處理30 min(功率400 W，頻率59 kHz)，過濾，再加入甲醇100 mL，超聲處理30 min，兩者合并濾過，減壓并濃縮至干燥，精密稱取10.7 mg，置于10 mL量瓶中，加體積分數為60%的甲醇溶液溶解并定容至刻度，振蕩搖勻；經微孔濾膜(孔徑為0.45 μm)濾過,棄去初濾液,得到續濾液,即供試品溶液。

2.4線性關系考察精密吸取Lico A對照品儲備液，質量濃度由低到高配制成6.937 5，13.875，27.75, 55.5和111 μg·mL-1的溶液，依次分別進樣10 μL，按照上述色譜條件測定待測物的峰面積。以質量濃度C(μg·mL-1)對主峰的峰面積(A)進行線性回歸，得回歸方程：Y=36 192X+30 278 (r=0.999 9)，Lico A進樣量在6.937 5~111 μg范圍內線性關系良好。

2.5精密度實驗精密吸取2.2項下的對照品溶液10 μL，在2.1項下的色譜條件下測定待測物的峰面積，連續進樣6次，結果顯示， 其精密度較為良好，Lico A的RSD為1.74%。

2.6重復性實驗取同一批次的樣品，按照2.3項下方法制備6份樣品溶液，在2.1項下的色譜條件下測定待測物的峰面積，結果顯示，甘草根部分中Lico A的平均含量為4.63 mg·g-1，RSD為1.84%，其重復性較為良好。

2.7穩定性實驗精密吸取2.3項下同一供試品溶液，在2.1項色譜條件下測定峰面積，在0，2，4，8，12和24 h測定峰面積，其RSD為2.27%，研究表明，供試品溶液中的Lico A在24 h內穩定。

2.8加樣回收率實驗取同一已知Lico A含量的供試品溶液6份約0.1 g，精密加入質量濃度為0.41 mg·mL-1的Lico A對照品1 mL，按照2.3項下方法處理，得供試品溶液。按照標準法進行測定并計算待測物的含量，結果見表1。

表1回收率實驗結果

Tab.1 The results of recovery test

(n=6)

2.9樣品測定分別精密稱取脹果甘草3個不同部位的樣品，按照2.3項下方法測定，計算Lico A的含量，結果表明，甘草根中Lico A的平均含量為0.468%，甘草莖中Lico A的平均含量為0.254%，而甘草葉中未檢出Lico A。

色譜圖見圖1。

圖 1 HPLC 圖

a.對照品；B.樣品；1.甘草查爾酮A

Fig.1 HPLC chromatograms

a. reference substances；B. sample；1. licochalcone A

3討論

Lico A是脹果甘草中的一種特異性成分，研究表明， Lico A具有明顯的抗前列腺癌和抗乳腺癌活性，并能抑制癌細胞的擴散轉移[10-13]。然而，脹果甘草中Lico A的含量很低，用化學方法人工合成使成本更高且工藝路線更復雜[14-15]。這促使人們尋找Lico A的新資源和新來源。

本實驗在文獻方法[14]的基礎上，優化了實驗條件，并利用HPLC法對新疆脹果甘草全草進行Lico A的分布特征研究，并發現了全草中Lico A的新存在部位。首先分別對已鑒定的脹果甘草根、莖、葉用甲醇提取進行制備，然后利用HPLC法，以Lico A為對照品，用已有的色譜條件，以甲醇-水-冰醋酸(60∶40∶1)為流動相進行含量測定，結果脹果甘草根和莖中Lico A的含量分別為0.468%和0.254%，而甘草葉中沒有顯示出該特征峰。

新疆脹果甘草全草中查爾酮類活性成分Lico A的含量測定未見文獻報道，因此本研究結果具有重要意義。從脹果甘草中提取制備Lico A時，合理利用甘草莖，在保護甘草資源及甘草地上部分的綜合開發利用中具有一定的價值。本研究結果顯示，在抗癌活性成分Lico A新資源的研究中、促進脹果甘草莖的藥用開發利用中、甘草根資源保護中以及脹果甘草品種的快速鑒定研究中，將體現出其重要的意義。

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Determination of licochalcone A in whole plant of XinjiangGlycyrrhizainflateby HPLC

Shirzat ABLAT, YANG Xuchao, Mourboul ABLISE*, REN Bingzhao(Department of Medicinal Chemistry, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Abstract:Objective To measure the content of licochalcone A in the whole plant of Glycyrrhiza inflata Bat (GIB) from Xinjiang origin．Methods HPLC method was used to perform a quantitative analysis of licochalcone A content in the root, stem and leaves of GIB plant. Hypersil ODS2 C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used; the mobile phase was composed of methanol-water-glacial acetic acid (60∶40∶1) mixture , with a flow rate of 1.0 mL·min-1; the detection wavelength was 372 nm at 25 ℃. Results Licochalcone A was linear in the concentration range of 6.937 5-111 μg·mL-1(r=0.999 9); the average recovery rate was 99.6% with corresponding RSD of 1.5%. The content of licochalcone A in the root was 0.468%, and in the stem was 0.254%, however licochalcone A was not detected in the leaf. Conclusion Licochalcone A is mainly distributed in the root and stem of Glycyrrhiza inflata Bat. The stem may be a new resource of licochalcone A.

Key words:Glycyrrhiza inflata Bat;licorice whole plant; licochalcone A; HPLC

(收稿日期：2015-10-26)

*通信作者：木合布力·阿布力孜，男，博士，教授，博士生導師

作者簡介：西力扎提·阿不來提，男，在讀碩士研究生

基金項目：國家自然科學基金項目(編號：81260379)

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0130-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.006