鼻咽癌CNE1放射抗拒細胞亞系CNE1/70R與親代細胞的差異

朱玲, 程金建, 許玲玉，楊華

(1廣西醫科大學，南寧530021； 2廣西壯族自治區人民醫院)

?

鼻咽癌CNE1放射抗拒細胞亞系CNE1/70R與親代細胞的差異

朱玲1, 程金建2, 許玲玉1，楊華1

(1廣西醫科大學，南寧530021； 2廣西壯族自治區人民醫院)

摘要：目的探討鼻咽癌CNE1細胞及放射抗拒細胞亞系CNE1/70R細胞在倍增時間、放射敏感性、藥物敏感性、細胞凋亡、細胞周期方面的差異。方法用臨床常規分割根治劑量70 Gy體外照射建立鼻咽癌放射抗拒細胞模型CNE1/70R。采用生長曲線檢測CNE1及CNE1/70R兩株細胞倍增時間，細胞克隆形成實驗比較細胞放射敏感性，MTT法檢測細胞對藥物多西紫杉醇、順鉑的敏感性，流式細胞術檢測細胞凋亡和周期的變化。結果CNE1/70R和CNE1細胞的倍增時間分別為(1.612±0.069)、(1.481±0.046)d；與CNE1細胞比較，CNE1/70R細胞的放射抗拒性增強，對化療藥物多西紫杉醇和順鉑敏感性增高；細胞經照射后，CNE1細胞G2/M期阻滯較CNE1/70R細胞更加明顯；細胞經照射相同劑量后，CNE1細胞凋亡率高于CNE1/70R細胞。以上觀察指標比較，兩株細胞差異均有統計學差異(P均<0.05)。結論成功建立人鼻咽癌放射抗拒株CNE1/70R，且與親代細胞在放射及藥物治療敏感性方面有穩定差異。

關鍵詞：鼻咽腫瘤；放射敏感性；細胞凋亡；細胞周期；多西紫杉醇；順鉑

鼻咽癌是我國南方地區的一種常見惡性腫瘤。由于其特殊的病理類型、生物學行為和解剖結構，放射治療(放療)仍是首選的治療方法。然而單純放療的鼻咽癌患者5年生存率約為 50%，其治療失敗的原因之一是鼻咽癌組織中存在一定比例對放射線有抗拒作用的細胞[1]。目前，國內外已成功地運用輻射誘導建立起放射抗拒的人腦膠質瘤、纖維肉瘤等對比研究模型[2,3],并對這些細胞株作放射抗拒機制的初步研究。2014年8月～2015年11月，我們建立鼻咽癌CNE1細胞及放射抗拒細胞亞系CNE1/70R，為探討鼻咽癌放射抗拒的分子機制提供理論基礎。

1材料與方法

1.1 材料人鼻咽癌CNE1細胞由中科院上海生物學研究所提供，培養于37 ℃、5% CO2含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培養液中。多西紫杉醇、順鉑購于山東齊魯制藥有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產品。細胞凋亡試劑盒、細胞周期試劑盒購于BD公司。放射源為X射線。用臨床常規分割根治劑量70 Gy(6 MV X線，70 Gy/35 d，2 Gy/d，1次/d，5次/周)體外照射建立鼻咽癌放射抗拒細胞模型CNE1/70R。

1.2 繪制細胞生長曲線取CNE1、CNE1/70R對數生長期細胞，胰酶消化，以l×104/mL的密度常規培養于24孔板中，每孔1 mL，每日取其中的3孔用胰酶消化后進行細胞計數。連續觀察及計數7 d，重復3次。以培養時間為X軸、細胞數目為Y軸繪制細胞的生長曲線。

1.3照射細胞克隆形成觀察取CNE1、CNE1/70R對數生長期的細胞，消化、計數、稀釋，分別接種不同數目于6孔板中，根據接種的細胞數分別給0、1、2、3、4、6、8 Gy照射；照射后的細胞繼續培養2周，甲醇固定、吉姆薩染色，計數形成的集落數。結果通過Graph pad6.0軟件采用單擊多靶模型處理，模型方程為SF2=1-(1-e-D/D0)×N。

1.4藥物對兩組細胞的抑制作用檢測 采用MTT比色法。細胞按密度為2×104/mL加入96孔板，每孔200 μL。待細胞長至對數生長期，加入稀釋后的多西紫杉醇、順鉑。順鉑濃度為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL，多西紫杉醇濃度為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μmol/L，每個濃度設置3個復孔，每孔總體積200 μL，1個空白對照。細胞培養48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續培養4 h。吸出上清培養基，每孔再加入DMSO 150 μL，輕微振蕩溶解結晶。于490 nm波長進行檢測，在酶標儀上檢測各孔的吸光度(OD值)。

1.5細胞周期檢測采用流式細胞術。將兩組細胞接種于6孔板中，分別采用0、8 Gy照射，照射24 h后收集細胞用PBS 洗滌、離心2次，加入PI染色液0.5 mL，冰上避光染色 15 min，上機檢測。

1.6細胞凋亡檢測采用流式細胞術。取兩組對數生長期細胞，接種于6孔板中，分別采用0、4、8、12 Gy照射48 h收集細胞，每樣本為1×106/mL。PBS洗滌、離心2次，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 和5 μL的 PI，避光室溫反應15 min，上機檢測。

2結果

2.1兩組細胞生長曲線細胞接種24 h后已基本貼壁。CNE1/70R細胞生長速度較親代細胞CNE1慢,CNE1和CNE1/70R細胞的倍增時間分別為 (1.481±0.046)、(1.612±0.069)d,放射抗拒細胞株較親代延長(P<0.05)。見圖1。

圖1　CNE1及CNE1/70R細胞的生長曲線

2.2兩組細胞克隆形成情況CNE1細胞放射生物學參數D0、Dq、N、SF2 分別為2.930、0.206、1.073、0.482，CNE1/70R細胞分別為2.940、1.084、1.488 、0.612。D0、 Dq、N、SF2越大，放射抗拒性越大， CNE1/70R細胞放射抗拒性增強(P<0.05)。

2.3藥物對兩組細胞的抑制作用不同濃度多西紫杉醇、順鉑作用細胞48 h 后,多西紫杉醇對CNE1和CNE1/70R細胞的IC50分別為0.049、0.001 μmol/L。順鉑對CNE1和CNE1/70R細胞的IC50分別為1.008、0.337 μg/ mL,CNE1/70R細胞較親代細胞CNE1對多西紫杉醇和順鉑更加敏感。見表1。

2.4兩組細胞周期分布細胞照射后均出現G2/M期阻滯，CNE1 細胞的G2/M期阻滯是CNE1/70R的1.36倍，CNE1/70R細胞的G2/M期阻滯程度低于CNE1細胞。詳見表2。

表1　不同濃度多西紫杉醇、順鉑對兩組細胞的

注：與CNE1/70R組相同濃度比較,*P<0.05。

表2　CNE1及CNE1/70R細胞經照射后細胞

注：與CNE1/70R組相同照射劑量比較，*P<0.05。

2.5不同照射劑量照射兩組細胞凋亡情況CNE1及CNE1/70R細胞分別照射0、4、8、12 Gy，48 h后，隨劑量增加，兩株細胞凋亡率增加，相同照射劑量下，CNE1/70R細胞凋亡率低于CNE1細胞。詳見表3。

表3　不同照射劑量兩組細胞凋亡率比較±s)

注：與CNE1/70R組同照射劑量比較,*P<0.05。

3討論

腫瘤細胞異質性的存在使得同一來源的腫瘤組織細胞表現出多樣的生物學特性，同一細胞群中存在放射敏感亞群和抗拒亞群，因此在射線間歇性反復照射過程中，敏感的細胞被射線殺滅，抗拒的細胞則存活并繼續增殖，由此篩選出放射抗拒細胞系CNE1/70R。應用集落形成實驗對其放射抗拒性進行評價，存活曲線以及相關放射生物學參數D0、Dq、N、SF2均提示CNE1/70R細胞較其親代細胞更具放射抗拒性。

有研究表明，凋亡與放射敏感性之間具有重要的指示關系。 Mitsubashi等[4]發現,在整個細胞群體中,照射后以凋亡形式死亡的細胞所占比例越大,其放射敏感性越高,這是衡量放射敏感性的重要指標。Broaddus等[5]在實驗中將腺病毒介導的wtp53轉染至含有mtp53的惡性神經膠質細胞瘤,也顯示在輻射敏感性增強的同時細胞凋亡數目顯著增多。因此，放射敏感性是影響凋亡至關重要的因素之一。本結果顯示CNE1/70R細胞凋亡率低于CNE1細胞，提示著CNE1/70R放射抗拒性較親代細胞增強。

有研究表明，處在不同細胞周期的細胞對放射的敏感性不同[6，7]。處于 S期的腫瘤細胞對射線最不敏感，G1期較為敏感，而G2期的細胞最為敏感。不敏感細胞比例增加，使得細胞在射線照射時更有可能表現抗拒性[8]。因此改變腫瘤細胞周期可影響腫瘤細胞的放射敏感性[9]，本研究中，射線照射后CNE1/70R細胞G2/M期阻滯程度不如CNE1細胞明顯，S期細胞比例相對高于CNE1細胞，提示CNE1/70R細胞較其親代細胞更具放射抗拒性。

化療藥物主要是通過破壞腫瘤細胞、引起腫瘤細胞凋亡而發揮治療作用。順鉑是一種臨床上常用的化療藥物，該藥通過將細胞周期阻斷在 G2/M 期來殺死腫瘤細胞，其中包括了鼻咽癌細胞。多西紫杉醇是一種新型半合成紫杉醇類衍生物,為有絲分裂抑制劑,可通過促進微管蛋白聚合及抑制解聚,保持微管蛋白穩定,使細胞分裂終止于G2/M期，誘導腫瘤細胞發生凋亡。順鉑、多西紫杉醇對腫瘤細胞的抑制作用與腫瘤細胞 G2/M期阻滯及放療抵抗的乏氧細胞再氧合[10]有關，細胞內的活性氧達到一定水平后也可導致細胞發生凋亡甚至壞死。因此，通過化療藥物有目的地改變細胞周期, 進而增強放療敏感性對腫瘤治療有重要意義。

綜上所述，CNE1/70R細胞株與親代細胞株相比，在放射敏感性和藥物敏感性上都存在統計學差異，其放射抗拒機制可能與周期分布改變及細胞凋亡有關。

參考文獻：

[1] Pearce AG, Segura TM, Rintala AC, et al. The generation and characterization of a radiation-resistant model system to study radioresistance in human breast cancer cells[J].Radiat Res, 2001,156(1):739-750.

[2] 程金建，胡震，夏云飛，等. 人腦膠質瘤細胞MGR2放射抗拒性的誘導[J].癌癥，2006,25(1):45-50.

[3] Wei K, Kodym R, Jin C. Radioresistant cells strain of human fibrosarcoma cells obtained after long-term exposed to X-rays[J]. Radiat Environ Biophys, 1998,37(2):133-137.

[4] Mitsubashi N, Takahashi T, Sakurai M, et al. A radioresistant variant cell line, NMT-1R, isolated from a radiosensitive raryolksac tumor celI 1ine. NTM-1: differences of ear1y, radiation induced morphological changes, especially apoptosis[J]. Int J Radiat Biol, 1996,69(3):329-336.

[5] Broaddus WC, Liu Y, Steele LL, et al. Enhanced radiosensitivity of malignant glioma cells after adenoviral p53 transduction[J]. J N eurosurg, 1999,91 (6):997-1004.

[6] Ree AH, Bratland A, Sloberg Landsverk K, et al, Ionizing radiation inhibits the PLK cell cycle gene in a G2 checkpoint dependent manner[J].Anticancer Res, 2004,24(2B):555-562.

[7] Hill JW, Tansavatdi K, Lockett KL, et al, Validation of the cell G(2)delay assay in assessing ionizing radiation sensitivity and breast cancer risk[J].Cancer Manag Res, 2009,30(1):39-48.

[8] van Bree C, Rodermond HM, ten Cate R, et al. G0cell cycle arrest alone is insufficient for enabling the repair of ionizing radiation induced potentially lethal damage[J]. Radiat Res, 2008,170(2):184-191.

[9] Pawlik TM, Keyomarsi K. Role of cell in mediating sensitivity to radiotherapy [J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004,59(4):928-942.

[10] Dunne AL, Mothersill C, Robson T, et al. Radiosensitization of colon cancer cell lines by docetaxel: mechanisms of action[J]. Oncol Res, 2004,14(9):447- 454.

Differences between radioresistant cell subline CNE1/70R of nasopharyngeal carcinoma CNE1 and its parental cell line

ZHULing1,CHENGJinjian,XULingyu,YANGHua

(1GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:Objective To investigate the differences in the doubling time, radiosensitivity, drug sensitivity, apoptosis and cell cycle distribution between nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells and radioresistant cell subline CNE1/70R. MethodsUsing a radical cure dose (70 Gy) of clinical routine segmentation in vitro irradiation to establish radioresistant nasopharyngeal carcinoma cell line model CNE1/70R. The doubling time of the two cell lines CNE1 and CNE1/70R was measured by cell growth curve. The radiobiological characteristics of the two cell lines were analyzed by the colony forming assay. MTT was used to test the drug sensitivity of the two cell lines to docetaxel and cisplatin. The apoptosis and cell cycle was analyzed by flow cytometry. ResultsThe doubling time of CNE1/70R and CNE1R cells was respectively (1.612±0.069) d and (1.481±0.046) d. The result of colony formation assay showed that the radioresistance of CNE1/70R cells was stronger than that of CNE1. Compared with CNE1 cells, CNE1/70R cells were more sensitive to the drugs. After irradiation, the CNE1 cells blocked in the G2/M phase were more than those of CNE1/70R cells, CNE1 arrested more obvious than CNE1/70R. After the same dose of irradiation, the apoptosis rate of CNE1 cells was higher than that of CNE1/70R cells. Significant differences were found in the above indexes between these two cell lines (all P<0.05). ConclusionsWe successfully establish radiaoresistant nasopharyngeal carcinoma cell subline CNE1/70R, and it has stable difference with its parental cell line in radiosensitivity and drug sensitivity.

Key words:nasopharyngeal neoplasms; radiosensitivity; apoptosis; cell cycle; docetaxel; cisplatin

(收稿日期：2015-10-26)

中圖分類號：R739.6

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)05-0016-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.05.006

通信作者簡介：楊華(1977-),女，副教授，研究方向為腫瘤藥理學和放射生物學，主持省自然科學基金項目研究2項，申請專利1項，發表學術論文多篇。E-mail：yanghuaz@163.com

作者簡介：第一朱玲(1992-)，女，在讀碩士，研究方向為腫瘤藥理學和放射生物學。E-mail：592054762@qq.com

基金項目：廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFBA053106)； 國家自然科學基金資助項目(81160284)。