急性髓細胞性白血病基因表達特點分析

王　潔　　葉　芳　　李國霞　　喬振華　　馬東升.山西醫科大學第二醫院血液科，山西太原　03000；.清華大學附屬北京市垂楊柳醫院血液科，北京　000

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急性髓細胞性白血病基因表達特點分析

王潔1葉芳2李國霞1喬振華1馬東升1
1.山西醫科大學第二醫院血液科，山西太原030001；2.清華大學附屬北京市垂楊柳醫院血液科，北京100022

[摘要]目的探討急性髓細胞性白血病（AML）患者的基因表達特點及臨床意義。方法選取2014年3月～2015年1月山西醫科大學第二醫院收治的94例初發AML患者，采用逆轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測WT1、P53、DNMT3A、NPM1、PML/RARa、FLT3-ITD、C-KIT、AML1/ETO、TET2、ASXL1基因的表達情況。結果AML患者（急性早幼粒細胞白血病除外）中WT1陽性最常見（69.1%），其次為AML1/ETO陽性（24.5%）、NPM1陽性（14.9%）、FLT3-ITD突變陽性（14.9%）；其中，1個基因陽性者最常見，占46.8%，2個基因陽性者占28.7%，3個及以上基因陽性者占20.2%；DNMT3A、NPM1多表達于AML-M4，C-KIT、AML1/ETO陽性多見于AML-M2；APL患者PML/RARa融合基因占100%，其中同時FLT3-ITD突變者3例，占27.27%；94例AML患者中，65例WT1表達陽性，其中19例初診陰性的患者在隨訪過程中隨著WT1增高而呈復發或復發傾向；另外46例初發時WT1升高患者經誘導治療后34例獲得第1次完全緩解或者部分緩解，并且WT1降低。結論基因表達在AML的診斷和療效評估中起重要作用。[關鍵詞]急性髓細胞性白血病；基因表達；診斷；預后

急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干細胞的惡性克隆性疾病，因白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻，而停滯在細胞發育的不同階段，僅憑骨髓細胞形態學進行分型診斷，其準確率約占70%。隨著分子生物學技術的迅速發展，基因

1　資料與方法

1.1一般資料

所有病例來自2014年3月～2015年1月山西醫科大學第二醫院血液科確診為AML的住院患者。其

中，男48例，中位年齡58歲；女46例，中位年齡51歲。根據法、美、英分型系統（FAB）診斷標準將患者分為AML未分化型（AML-M1）2例、AML部分分化型（AML-M2）35例、急性早幼粒細胞白血病（APL）11例、急性粒-單核細胞白血病（AML-M4）29例、急性單核細胞白血病（AML-M5）5例、急性紅白血病（AML-M6）8例、未定型的AML 4例。WT1基因檢測時間：初診治療前；1個療程標準方案誘導化療后。

1.2方法

1.2.1提取DNA/RNA抽取抗凝骨髓2 mL，參照美國Qiagen公司全血基因提取試劑盒說明書，提取基因組DNA/RNA。

1.2.2引物設計引物從GeneBank檢索基因序列，由北京奧科生物技術公司設計并合成，PAGE純化。PCR擴增引物序列見表1。

表1　PCR擴增引物序列

1.2.3RT-PCR方法檢測基因反應體系：10×buffer 2.5μL，25 mmol/L MgCl 21.5μL，10 mmol/L dNTP 0.5μL/L，20μmol/L引物，TaqDNA聚合酶1.5μL，模板DNA 4μL，加去離子液至總體積25μL。反應條件：94℃預變性3min，開始35個循環，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃總延伸10 min。PCR產物凝膠電泳，用UVP凝膠成像分析系統（美國UVP公司）攝片或送上海基康生物技術有限公司純化并進行測序分析。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料采用Wilcoxon秩和檢驗，相關性采用Spearman秩相關，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1檢測結果

基因陽性電泳圖見圖1～4。

圖1　PML/RARa電泳圖

圖2　AML 1/ETO電泳圖

圖3　FLT 3-I TD垂直膠電泳圖

圖4　NPM 1垂直膠電泳圖

2.2AML患者各基因表達

融合基因表達由高到低依次為WT1、AML1/ETO、NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A、PML/RARa、C-KIT、P53、TET2、ASXL1，可見WT1增高最常見，其次為AML1/ ETO突變，再次為NPM1、FLT3-ITD突變。目前為止尚無ASXL1突變陽性的患者。DNMT3A突變患者91.7%為AML-M4，NPM1突變患者57.1%為AMLM4，C-KIT突變患者77.7%為AML-M2，AML1/ETO突變患者91.3%為AML-M2，可見DNMT3A、NPM1突變多見于AML-M4患者，C-KIT、AML1/ETO突變多見于AML-M2患者。所有患者發生1個基因突變者占46.8%，2個基因突變者占28.7%，3個及以上基因突變者占20.2%，得出1個基因突變者最常見，其次為2個基因突變，3個及以上基因突變最少見。APL患者100%存在PML-RARa基因，27.3%的APL患者合并FLT3-ITD基因突變。見表2。

表2　9 4例AML患者融合基因表達的情況（例）

2.3初診WT1增高患者誘導治療后WT1的變化情況

初診WT1陽性患者46例，誘導治療后隨訪患者37例，其余9例因未復查WT1或復查后結果未回報亦或因某種原因放棄治療而失訪；初診時WT1 （1720.73±2805.90）WT1/104*ABL拷貝數，誘導治療后WT1（379.50±1165.76）WT1/104*ABL拷貝數，后者明顯低于前者；隨訪患者中34例誘導治療后獲得完全緩解或者部分緩解，并且WT1減低，3例未緩解。采用Wilcoxon秩和檢驗得出Z=-4.32，差異有高度統計學意義（P＜0.01），說明治療有效，WT1可以作為評價療效的指標。

2.4初診時WT1陰性患者隨訪過程中WT1值與復發的相關性

19例初診WT1陰性患者誘導治療后隨訪過程中WT1值升高，骨髓原始細胞百分比例顯著增高，呈復發或復發傾向，采用Spearman秩相關檢驗，得出r= 0.48，P=0.014，差異有統計學意義。見圖5。

圖5　WT 1與復發關系的散點圖

3　討論

據有關文獻報道NPM1、DNMT3A、FLT3-ITD突變多見于年輕、女性、骨髓原始細胞比例較高患者，DNMT3A為總體生存期的獨立影響因子，小于60歲年輕患者同時存在三種基因突變，預后、無病生存期、總體生存期較差[1]。NPM1陽性多見于AML-M4、AML-M5[2]，FLT3-ITD在APL、正常核型AML患者中升高[3]。在非APL患者中，FLT3-ITD突變預示完全緩解率和總生存期明顯縮短[4]。FLT3-ITD、C-KIT均是與發病相關的酪氨酸激酶，索拉菲尼是一種多靶點激酶抑制劑，已成為一種非常有前景的藥物。本研究得出27.3%的APL患者合并FLT3-ITD基因突變，此結果與文獻一致[5]；但本研究NPM1多見于AML-M4患者，僅有2例表達于AML-M5，與相關文獻有所不同[6-7]，可能與隨訪時間短、病例數少有關。

相關文獻報道WT1基因突變提示預后不良，無病生存期、總體生存期縮短[8]。AML患者WT1陽性表達率為76.9%，表達水平在各亞型間差異：AML-M1表達居最高水平，APL相對較低。復發高峰期平均在2.5個月，WT1水平多數再上升10～100倍[9]。本研究顯示WT1陽性表達率為69.1%，但AML-M2表達居最高水平，可能與AML-M2患者數量較多有關。

PubMed有文獻報道ASXL1多見于老年、男性、繼發急性髓細胞白血病、骨髓原始細胞百分比例較低的患者，與NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A呈負相關性，ASXL1突變患者具有低完全緩解率、短無事件生存期，高死亡率，尤其合并RUNX1突變提示預后不良[10]。本研究尚無ASXL1突變患者，考慮可能與收集病例數少、ASXL1陽性率低有關。

1973年Rowley等[11]第1次提出t（8；21）（q22；q22）染色體易位，產生特異性的AML1/ETO融合基因，AML-M2中其發生率可高達40%～80%[12]。2001年世界衛生組織（WHO）將伴有t（8；21）（q22；q22）AML1/ ETO的AML定義為獨立亞型，可診斷為t（8；21）AML[13]。其定量檢測是監測微小殘留病的一個敏感指標[14]，拷貝數的高低與治療、緩解率及復發相關[15]。在危險分層中AML1/ETO陽性往往被認為是預后較好的類型；但同時有高白細胞、髓外浸潤、附加染色體異常等[16]高危因素的患者，雖然化療可取得一定的療效[17]，但是異基因造血干細胞移植比單純化療有較好的長期生存率。AML1/ETO陽性的患者C-KIT D816V和N822K突變常見，預后差，骨髓原始細胞比例較高，C-KIT基因突變檢測對治療和預后有重要意義[18]。

TET2在白血病發生中主要表現為抑癌基因功能，可抑制造血干細胞/祖細胞（hematopoietic stem cell/progenitor cell，HSPC）異常自我更新，其功能丟失時可能參與疾病發生。TET2突變的患者預后不良，與無事件生存率、緩解率呈負相關[19]，并常合并DNMT3A和JAK2等基因的突變，提示白血病形成的不同階段[20]。

[參考文獻]

[1]LoghaviS，ZuoZ，RavandiF，etal.Clinical featuresofDeNovo acute myeloid leukemia with concurrent DNMT3A，FLT3 and NPM1mutations[J].Hematol Oncol，2014，7（1）：74.

[2]Gale RE，Green C，Allen C，et al.The impact of FLT3 internal tandem duplication mutant level，number，size and interaction with NPM1mutations in a large cohort of young adult patients with acute myelaid leukemia[J].Blood，2008，111（5）：2776-2784.

[3]Small D.FLT3mutation：biology and treatment[J].Hematology Am Sac Hematol Educ Program，2006，2006（1）：178-184.

[4]朱化超，賀鵬程，程小巖，等.FLT3-ITD基因在急性髓細胞白血病患者中的突變及對預后影響分析[J].臨床血液學雜志，2015，28（5）：392-395.

[5]Man CH，Fung TK，Ho C，et al.Sorafenib treatment of FLT3-ITD（+）acute leukemia：favorable initial outcome and mechanisms of subsequent non responsiveness associated with the emergence of a D835 mutation[J].Blood，2012，119（6）：5133-5143.

[6]Sammons SL，Pratz KW，Smith BD，et al.Sorafenib is tolerable and improves clinical outcomes in patients with FLT3-ITD acute leukemia prior to stem cell transplant and after relapse post-transplant[J].Am JHematol，2014， 89（3）：936-938.

[7]Baker SD，Zimmerman EL，Wang YD，et al.Emergence of polyclonal FLT3 tyrosine kinase domain mutations during sequential therapy with Sorafenib and sunitinib in FLT3-ITD-positive acute leukemia[J].Clin Cancer Res，2013，19（20）：5758-5768.

[8]Paschka P，MarcucciG，Ruppert AS，et al.Wilms'tumor 1 gene mutations independently predict poor outcome in adultswith cytogenetically normal acutemyeloid leukemia：a cancerand leukemiagroup Bstudy[J].ClinOncol，2008，26（28）：4595-4602.

[9]張團結，鄧寬國，孫征，等.WT1基因在急性白血病患者中的表達及臨床意義[J].中外醫學研究，2014，12（20）：81-83.

[10]Paschka P，Schlenk RF，Gaidzik VI.ASXL1mutations in younger adult patients with acute myeloid leukemia：a study of the German-Austrian Acute Myeloid Leukemia Study Group[J].Haematologica，2015，100（3）：324-330.

[11]Rowley JD.Identification ofa translocationwith quinacrine fluorescence in a patient witII acute leukemia[J].Ann Geuet，1973，16（2）：109-112.

[12]Zhou GB，Kang H，Wang L，et al.Oridonin，aditerpenoid extracted from medicinal herbs targets AMl1-ETO fusion protein and shows potent antitumor activity with low adverse effects on t（801）leukemia invitro and in vivo[J]. Blood，2007，109（8）：3441-3450.

[13]程淑琴，謝偉成，謝碧霞，等.138例急性白血病MICM分型及預后分析[J].腫瘤基礎與臨床，2008，21（2）：158-160.

[14]玄風華，謝福源.討論伴t（8；21）的急性髓系白血病的形態學改變[J].江西醫學檢驗，2007，25（6）：634-636.

[15]苗雨青，陳子興，何軍，等.急性髓系白血病M2亞型患者的預后多因素分析[J].中華血液流變學雜志，2006，16（1）：87-89.

[16]趙杰，殷宇明，楊君芳，等.83例AML1/ETO陽性急性髓系白血病的分子生物學和臨床特點分析[J].臨床血液學雜志，2012，25（6）：341-344.

[17]Pallisgaard N，Hokland P，Riishoj DC，et al.Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia[J].Blood，1998，92（2）：574-588.

[18]符爽，胡延平，陳芳，等.伴ETO或CBFB陽性的急性髓細胞白血病患者C-KIT基因突變的檢測及意義[J].現代腫瘤醫學，2015，23（11）：1581-1584.

[19]王敬毅，郝建國，崔興，等.TET2基因與白血病研究進展[J].浙江中西醫結合雜志，2015，25（6）：622-624.

[20]KoM，RaoA.TET2：epigenetic safeguard forHSC[J].Blood，2011，118（17）：4501-4503.

Analysis of gene expression characteristics in acutem yeloid leukem ia

WANG Jie1YE Fang2LIGuoxia1QIAO Zhenhua1MA Dongsheng1
1.Department of Hematology,the Second Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi Province,Taiyuan 030001, China;2.Department of Hematology,Beijing Chuiyangliu Hospital Affiliated to Tsinghua University,Beijing 100022, China

[Abstract]Objective To investigate the gene expression characteristics of acute myeloid leukemia(AML)and their clinical significance.M ethods Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect WT1, P53,DNMT3A,NPM1,PML/RARa,FLT3-ITD,C-KIT,AML1/ETO,TET2,ASXL1 gene expressions in 94 new diagnosed AML patients in the Second Hospital of Shanxi Medical University from March 2014 to January 2015.Results AML patients(except for acute promyelocytic leukemia)with WT1 positivewere themost common(69.1%),followed by AML1/ETO positive(24.5%),NPM1 positive(14.9%),FLT3-ITD positive(14.9%).Moreover,one gene positive patients were themost common(46.8%),2 gene positive patients accounted for 28.7%,3 ormore gene positive patients accounted for 20.9%.Furthermore,DNMT3A,NPM1 expressedmore in AML-M4.C-KIT,AML1/ETO expressed more in AMLM2.PML/RARa fusion genewas 100%in APL patients,and 3 patientswith FLT3-ITDmutation,accounted for 27.27%. Among all 94 AML patients,WT1 gene expression was positive in 65 patients.19 new diagnosed AML patients whose WT1 were negative showed recurrence or tendency of recurrence with the increase ofWT1 in the follow-up process.In 46 new diagnosed AML patientswhoseWT1 gene expressionswere positive transfered to negativewhen 34 cases among these patients got complete remission or partial remission after inductive chemotherapy,and WT1 was decreased.Conclusion Gene expression plays an important role in the diagnosis and effect evaluation of acutemyeloid leukemia.

[Key words]Acutemyeloid leukemia;Gene expression;Diagnosis;Prognosis

收稿日期：（2015-08-20本文編輯：張瑜杰）

[通訊作者]葉芳（1973.9-），女，博士，副主任醫師，碩士研究生導師；研究方向：惡性血液病的診斷與治療。檢測和微小殘留病灶監測對AL的診斷、分型、治療方案的選擇和療效評估具有重要意義。本研究總結了94例初發急性髓細胞性白血病（AML）患者的基因表達情況，并對其特點進行分析，探討其臨床意義，現報道如下：

[作者簡介]王潔（1989.8-），女，碩士；研究方向：惡性血液病的診斷與治療。

[中圖分類號]R733.71

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-7210（2016）01（a）-0013-04