高同型半胱氨酸血癥對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin WT1表達的影響

梁 靜， 張 淵， 孟祥龍， 王 莉

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院城東病區腎臟科， 四川 成都 610110 2.四川省醫學科學院/四川省人民醫院腎臟科， 四川 成都 610072)

?

高同型半胱氨酸血癥對膜性腎病大鼠腎組織Nephrin WT1表達的影響

梁 靜1， 張 淵2， 孟祥龍1， 王 莉2

(1.四川省醫學科學院/四川省人民醫院城東病區腎臟科， 四川 成都 610110 2.四川省醫學科學院/四川省人民醫院腎臟科， 四川 成都 610072)

【摘 要】目的:觀察高同型半胱氨酸血癥對膜性腎病(MN)大鼠腎組織Nephrin、WT1表達的影響，探討MN足細胞損傷凋亡的可能發生機制。方法:將30只SD雄性大鼠隨機分為正常組和模型組，正常組不給予任何處理，模型組尾靜脈注射16mg/ kg陽離子化牛血清白蛋白(c-BSA)復制MN大鼠模型，于正式免疫第1，2，3，4周末檢測24h尿蛋白(24h UTP)水平，并于第4周末檢測大鼠血漿尿素(Ure)、血肌酐(Cre)及同型半胱氨酸(Hcy)水平。同時取材鑒定大鼠腎組織成模情況，免疫組化檢測大鼠腎組織中Nephrin、WT1的表達，結果:模型組大鼠造模第4周成模穩定，病理表現典型。隨造模時間延長，模型組24h UTP呈逐漸增加趨勢，與前一周末比較差異均有統計學意義(P<0.01)，2、3、4周末24h UTP較正常組有明顯增加(P<0.01)。Nephrin在模型組腎組織中表達較正常組顯著減少(P<0. 01)，WT1的表達與正常組比較無顯著差異。HCY與腎組織Nephrin的表達呈明顯負相關，與第4周末24hUTP呈明顯正相關，與血漿尿素、血肌酐、腎組織WT1無明顯相關關系。結論:MN中高Hcy血癥可能通過下調Nephrin的表達參與了足細胞的損傷凋亡過程，積極監測Hcy水平及控制高Hcy血癥有利于防止MN的進展。

【關鍵詞】膜性腎??； 同型半胱氨酸； Nephrin； WT1； 陽離子化牛血清白蛋白

膜性腎病(Membranous nephropathy，MN)是成人腎病綜合征的主要原因，嚴重地危害人類的健康，MN的發病機制復雜，目前認為足細胞的活化及損傷是膜性腎病發展的一個重要機制，當前研究主要針對足細胞病變所導致的腎小球濾過屏障的損傷[1]。Nephrin是近幾年來發現的一種跨膜糖蛋白，它特異地表達在足細胞的裂孔膜上，對于維持正常的腎小球濾過功能具有重大意義[2]。WT1(Wilms.腫瘤抑制基因)是一種鋅指樣轉錄因子，定位于表達在足細胞核，是足細胞特異性標志之一，足細胞WTl蛋白表達的減少可作為足細胞凋亡的標志[3]。較多研究表明，腎病綜合征患者Hcy水平較正常顯著升高，其是否與MN腎組織Nephrin、WT1表達相關，尚未見報道。本研究通過監測MN腎組織中Nephrin、WT1的表達情況，并探討其與Hcy水平的關系，為臨床早期預測MN足細胞損傷提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料:天然牛血清白蛋白、無水乙二胺(EDA)、4M醋酸緩沖液(PH=4.75)(均購自國藥集團化學試劑成都有限公司)，碳化二亞胺(EDC)、羊毛脂、液體石蠟(均購自廈門星隆達化學試劑公司)，PASM染色試劑盒及Masson染色試劑盒(購自福州邁新生物試劑有限公司)，兔抗大鼠IgG多克隆抗體及異硫氰酸熒光素標記羊抗兔熒光抗體(武漢博士德生物公司)，兔抗鼠Nephrin抗體及WT1抗體(1:50，Santa Cruz公司，美國)。

1.2 模型制備與分組:成年健康雄性SD大鼠30只，適應性喂養7d，檢測24h尿蛋白(24h UTP)，均小于5mg。大鼠隨機分為兩個組:正常組(10只)、模型組(20只)，參照改良Border方法[4]，將牛血清白蛋白經EDC處理后制成陽離子化牛血清白蛋白(c-BSA)，用c-BSA制作大鼠膜性腎病模型，模型組大鼠每只取CBSA 1mg溶解于0.5mL生理鹽水中與等量不完全弗氏佐劑(自備)充分乳化，在大鼠頸背部皮下多點注射作預免疫。預免疫1周后正式免疫，每只造模大鼠隔日尾靜脈注射C-BSA(16mg/ kg)[5]，連續4周，正常對照組大鼠隔日尾靜脈注射等體積生理鹽水，均連續4周。

1.3 模型鑒定:每組于正式免疫第1、2、3、4周末準確收集24h尿，定量檢測尿蛋白濃度，計算24h UTP水平，于實驗第4周末將大鼠處死取材，觀察腎臟大小、顏色；取部分腎組織用4%中性甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋制成蠟塊，切片，分別進行Masson、HE、PASM染色，光鏡下觀察腎組織病理改變情況；取部分腎組織石蠟包埋后切片，用抗體效價為1:40ul的異硫氰酸熒光素標記羊抗兔熒光抗體為二抗，兔抗大鼠IgG多克隆抗體為一抗，行間接熒光抗體染色法染色，熒光顯微鏡下行腎組織熒光定性觀察，觀察結果及判定用“+”表示:(+++ ~++++)熒光閃亮；(++)熒光明亮；(+)熒光較弱，但清楚可見；(±)極弱的可疑熒光；(-)無熒光。另取部分腎皮質分別用2.5%戊二酸、1%鋨酸進行前固定和后固定，脫水、包埋、切片處理，1%醋酸鈾染色，電鏡觀察腎組織病變情況。

1.4 血尿生化檢測:于造模第1、2、3、4周末前1d使用代謝籠收集24h尿行尿蛋白定量檢測，于造模第4周末右心室采血采用全自動生化分析儀檢測血漿尿素(Ure)、血肌酐(Cre)及同型半胱氨酸(Hcy)濃度。

1.5 腎組織Nephrin、WT1的檢測:均采用SP法，3um腎組織脫蠟至水，抗原熱修復，3%的H2O2阻斷清除內源性過氧化物酶；山羊血清封閉液30℃恒溫封閉30min，分別用抗體效價為1∶50ul的兔抗大鼠Nephrin、WT1多克隆抗體4℃孵育過夜，滴加抗兔抗體(生物素標記)，室溫孵育40min，滴加鏈霉親和素(辣根過氧化物酶標記)，30℃孵育40min；最后加DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應，蘇木素復染，中性樹膠封片。腎實質細胞胞漿內棕褐色顆粒顯示為陽性，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。Nephrin、WT1的免疫組化染色結果采用計算機醫學病理圖像處理系統進行分析。每例腎組織切片，在高倍視野下隨機選取面積相似的10個腎小球，對選取的腎小球內Nephrin、WT1免疫組化陽性信號進行圖像分析，計算陽性面積平均值，結果以陽性強度×陽性面積表示[6]。

1.6 統計學方法:全部數據采用SPSS17.0 for windows軟件包統計分析，結果用均數±標準差表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗，組內各時間點比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析，P<0. 05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況觀察:造模后模型組全部大鼠逐漸出現消瘦、懶動、納差、精神不振，抓持反抗能力明顯減弱，毛發欠光澤、脫落，部分大鼠出現腹水，陰囊水腫。腎組織較正常腎臟增大，包膜緊張，色稍白。

2.2 動物成模檢測:模型組:光鏡下可見腎小球腫大，球囊腔狹窄，腎小球毛細血管壁彌漫性增厚，部分GBM外側可見“釘突”形成，上皮下大量顆粒狀紅染沉積物，腎小管上皮腫脹，管腔狹窄；電鏡下可見GBM彌漫增厚，足突變平、融合或消失，上皮下可見分布不均的顆粒狀電子致密沉積物。正常組無上述改變。(見圖1)

2.3 臨床血尿生化指標檢測:組內比較:正常組各周末24hUTP無明顯差異；模型組隨造模時間延長，24hUTP逐漸增加，第2周末較第1周末增加顯著，第3、4周末均較前1周末增加顯著(P<0.01)。組間比較:模型組自第2周末起24hUTP均較正常組顯著增加(P<0.01)。第4周末模型組Hcy水平較正常組顯著升高(P<0.01)，而Ure、Cre較正常組無明顯差異(P >0.05)。(見表1、表2)

表1 兩組24h尿蛋白水平比較(±s，mg/ L)

表1 兩組24h尿蛋白水平比較(±s，mg/ L)

注:與正常組比較，*P<0.01；同一組別，與第1周比較，▽P<0.01；與第2周比較，▼P<0.01；與第3周比較，◆P<0.01

組別　　例數　　第1周末　　第2周末　　第3周末　　第4周末正常組　10　5.57±0.45　6.27±0.40　5.66±0.34　7.87±1.07模型組　20　4.97±0.30　47.26±8.06*▽　77.13±10.26*▽▼120.52±15.49*▽▼◆

表2 兩組血生化指標比較(±s)

表2 兩組血生化指標比較(±s)

注:與正常組比較，*P<0.01

組別　　例數　Ure(mmoL/ L)Cre(umoL/ L)Hcy(umoL/ L)正常組　10　 6.59±2.43　 52.75±11.30　 6.65±1.23模型組　20　 7.15±2.15 60.24±13.6518.33±10.45*

2.4 腎組織Nephrin、WT1的表達情況:正常組腎組織切片中可見nephrin呈淺棕色染色沿腎小球毛細血管襻呈均勻、線狀分布，腎小管有少量分布；模型組4周時Nephrin表達較正常組顯著減少，表達不均，稀疏，部分區域表達消失，兩組Nephrin表達水平差異有統計學意義(P<0.01)。WT1于MN4周時在足細胞核的表達呈深棕色粗大顆粒，與正常組比較無顯著性差異(P>0. 05)。(見表3、圖2)

表3 4周末兩組腎組織Nephrin、WT1的表達(±s)

表3 4周末兩組腎組織Nephrin、WT1的表達(±s)

注:與正常組比較，*P<0.01

組別　　例數　Nephrin　WT1正常組　10　12.35±3.78　 25.45±11.37模型組　20　5.62±2.03*　 22.60±14.16

圖1 兩組大鼠第4周腎組織Masson、PASM染色、免疫熒光及電鏡觀察

圖2 4周末兩組腎組織Nep.7mm。82.7mm；S1；hrin、WT1的表達情況A為正常組；B為模型組

2.5 血Hcy與血漿Ure、Cre及腎組織Nephrin、WT1的相關性:經Pearson相關分析顯示，模型組血漿Hcy與腎組織Nephrin的表達呈明顯負相關(r=-0.364，P<0. 05)，與第4周末24hUTP呈明顯正相關(r = 0.937，P< 0.05)，與血漿尿素、血肌酐、腎組織WT1無明顯相關關系。

3 討 論

膜性腎病(MN)近年來發病率逐年增長，目前認為MN發病中，足細胞的損傷凋亡有重要意義，足細胞的異常是導致蛋白尿的關鍵環節，當其出現損傷、凋亡，進而壞死、脫落，就會引起細胞數量減少和密度降低，尿蛋白漏出，導致腎小球進行性硬化及腎功能進展[7]。

Nephrin、WT1是近年來發現的足細胞相關蛋白，它們與足細胞及基底膜的結構和功能完整性濾過屏障的組成密切相關，因其特異地表達于足細胞，成為近年來研究足細胞疾病的熱門之一，既往較多研究證實，在多種腎小球疾病中，晚期腎小球硬化均可見Nephrin mRNA和蛋白表達及分布的異常，以及腎小球WT1表達的減少[8]。本研究發現，模型組電鏡下可見GBM彌漫增厚，足突變平、融合或消失，并可見上皮下電子致密物沉積。隨造模時間延長，24hUTP逐漸增加，免疫組化發現模型組4周時Nephrin表達較正常組顯著減少(P<0.01)，而WT1于MN4周時在足細胞核的表達與正常組無明顯差異(P>0.05)，由此可見MN造模4周時足細胞裂孔膜即出現明顯損傷，而此時足細胞細胞核無顯著變化，細胞數量沒有明顯減少，足細胞凋亡尚未大規模啟動，nephrin表達減少所表現的足細胞的損傷并沒有引起足細胞從腎小球基底膜( GBM)上脫落。Nephrin是腎小球濾過屏障的關鍵，Taiji等[9]研究證實無論是否有足細胞的脫落，nephrin的異常都會導致蛋白尿。本實驗也同樣證實了這樣的觀點，雖然模型組nephrin表達減少，WT1沒有明顯變化，但此時蛋白尿已較正常組明顯增加(P<0.05)，說明nephrin所反映的足細胞濾過屏障功能受損導致尿蛋白漏出。

足細胞的活化及損傷是MN發展的一個重要機制，電鏡下MN早期即可見足突的廣泛融合及消失。導致足細胞損傷的因素很多，包括:活性氧族(ROS)、高血壓、高血糖、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、感染、毒物及藥物等，從足細胞損傷到腎小球硬化是一個漸進性過程。有研究證實，其發展速度主要取決于足細胞損害及其損傷后數量減少的嚴重程度[10]。高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是動脈粥樣硬化(AS)性心血管疾病的獨立危險因素，其能否作為足細胞損傷腎小球硬化的又一因素，尚待研究。有研究表明，Hcy是一種含有硫基的血管損傷性氨基酸，參與血管病變的發生過程，其升高可直接造成血管內皮細胞損傷和血管功能異常。既往較多研究發現，腎病綜合征患者普遍存在高Hcy血癥。MN是腎病綜合征的重要原因，也是典型的足細胞疾病，因此，在MN中，高Hcy血癥是否與MN腎功能損害及足細胞病變有關，尚未見報道，本實驗看到，模型組Hcy水平較正常組顯著升高(P<0.01)，而Ure、Cre較正常組無明顯差異，說明MN早期腎功能正常時，已經出現Hcy水平的異常，從相關分析看出:于造模第4周末Hcy水平與腎功能無明顯關系，但隨MN發展，高Hcy血癥是否導致MN腎功能進一步受損，有待于后期實驗進一步證實。

研究指出:Hcy導致血管病變的發生機制可能與Hcy刺激血管平滑肌細胞增殖、影響血管壁膠原合成與連接、促進脂質沉積以及通過氧化應激損傷血管內皮、抑制內皮細胞產生前列環素等有關，本研究顯示，模型組血漿Hcy水平與腎組織Nephrin的表達呈明顯負相關(r=-0.364，P<0.05)，與第4周末24hUTP呈明顯正相關(r= 0.937，P<0.05)，與血漿尿素、血肌酐、腎組織WT1無明顯相關關系，提示高Hcy可能是MN足細胞損傷的又一發病機制，從相關性分析推測，Hcy可能通過下調Nephrin的表達參與了足細胞的損傷凋亡過程，同時高Hcy血癥加重尿蛋白的漏出，大量蛋白尿反過來加速了腎小球的硬化及足細胞的損傷，在足細胞損傷方面，與高Hcy導致血管病變的發生機制有所不同。

【參考文獻】

[1] Mani LY，Huynh-Do U，Horn MP.Membranse Glomerulopathie-eine autoimmunerkrankung[J].Ther Umsch，2015，72 (3):179~188.

[2] Li X，He JC. An update: the role of nephrin inside and outside the kidney[J].Sci China Life Sci，2015，58(7):649~ 657.

[3] Ohsaki H，Sofue T，Kawakami K，et al.WT1 immunoenzyme staining using surepath processed urine cytology helps to detect kidney disease[J].Cytopathology，2015，14.

[4] Border WA，Ward H，Bachelor RW，et al.Induction of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen[J].Clin Invest，1982，68:451.

[5] 梁靜，孫興旺，曹靈，等.不同劑量陽離子化牛血清白蛋白對膜性腎病大鼠造模的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12(37):7322~7325.

[6] 金周慧，陳以平，鄧躍毅.蟬花菌絲延緩腎小球硬化的作用機制研究[J].中國中西醫結合腎病雜志，2005，6(3): 132~136.

[7] Cellesi F，Li M，Rastaldi MP. Podocyte injury and repair mechanisms [ J]. Curr Opin Nephrol Hypertens，2015，24 (3):239~244.

[8] 石國娟，李紹梅，楊林，等.Nephrin和WT1在原發性腎病綜合征患者腎小球的表達及意義[J].臨床腎臟病雜志，2010，7(10):311~313.

[9] Taiji Matsusaka，Eric Sandgren. Podocyte injury damages other podocytes[J].Am Soc Nephrol，2011，22( 7) : 1275 ~ 1285.

[10] Kriz W.The pathogenesis of classic focal segmental glomerulos- clerosis lessons from rat models [ J]. Nephrol Dial Transplant，2003，18(6):39.

The Effects of Hyperhomocysteinemia on the Expression of Nephrin and WT1 in Membranous Nephropathy Rats Renal Tissue

LIANG Jing， et al
(Sichuan Academy of Medical Sciences＆Sichuan Provincial People's Hospital of east branch，Sichuan Chengdu 610110，China)

Abstract:Objective: To observe the effects of hyperhomocysteinemia (HHcy) on the expression of Nephrin and WT1 in renal tissues of MN rats，and to investigate the possible mechanism of MN podocytes apoptosis. Method: 30 SD male rats were randomly divided into normal group and model group，normal group without any treatment，Model group was duplicated by 16mg/ kg C-BSA tail vein injection on the basis of modified Border method. 24h urinary protein levels (24h UTP) were detected at the first，second，third and fourth weekend in formal immunity. Plasma urea (Ure)，serum creatinine (Cre) and homocysteine (Hcy) levels were detected at the fourth weekend. The expression of WT1 and Nephrin in rats renal tissues were detected by immunohistochemistry，and appraisal the MN model of rat kidney tissue. Result: The model is stable and the pathology is typical at the fourth weekend. 24h UTP gradually increased with the increase of the model time，and increased significantly compared to normal group at the third weekend (P<0.01). Nephrin expression in the model group was significantly decreased compared with the normal group (P<0.01)，the expression of WT1 was not significantly different from the normal group. The Hcy levels were significant negatively correlated with the nephrin expression，positively correlated with 24hUTP in fourth weeks，no significant correlation with Ure，Cre and expression of WT1. Conclusion: HHcy may down-regulate the expression of nephrin to participate in the apoptosis of the podocyte，actively monitor the levels of Hcy and control the HHcy to prevent the development of MN.

【Key words】Membranous nephropathy； Homocysteine； Nephrin； WT1； Cationic bovine serum albumin

【基金項目】四川省衛生廳科研課題，(編號:110238)通訊作者:王 莉，Email:scwangli62@ 163.com

【文章編號】1006-6233(2016)03-0470-05

【文獻標識碼】B 【doi】10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.03.042