mTOR通路下游核心分子的mRNA表達水平與初發AML患者臨床特征的關系

陳柯君　程輝　王健民　楊建民　呂書晴

(第二軍醫大學附屬長海醫院血液科，上海　200433)

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·論著·

mTOR通路下游核心分子的mRNA表達水平與初發AML患者臨床特征的關系

陳柯君程輝王健民楊建民呂書晴

(第二軍醫大學附屬長海醫院血液科，上海200433)

摘要目的：探討初發急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者骨髓單個核細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)、真核細胞翻譯啟始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E， eIF-4E)及真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白1(eIF4E binding protein 1， 4E-BP1)mRNA表達水平與臨床特征的關系。方法： 采用熒光定量RT-PCR檢測59例初發AML(AML組)和15名健康人(對照組)的骨髓單個核細胞中的4E-BP1、eIF-4E及mTOR mRNA表達水平，以正常人平均表達水平作為分組標準，結合AML患者的臨床特征進行相關分析。結果： AML組中4E-BP1、eIF-4E和mTOR mRNA高表達者分別占50.9%、59.4%和45.8%。4E-BP1高表達組PLT數顯著低于4E-BP1低表達組(P=0.044)；eIF-4E高表達組骨髓原始細胞比例高于eIF-4E低表達組，但差異無統計學意義(P=0.068)；mTOR高表達組骨髓原始細胞比例及髓外侵犯顯著高于mTOR低表達組(P=0.040，P=0.029)，mTOR高表達組貧血比例高于mTOR低表達組，但差異無統計學意義(P=0.082)。結論： mTOR通路下游核心分子的mRNA表達水平與初發AML患者骨髓原始細胞增殖、PLT數、貧血及髓外侵犯關系密切，相關檢測有望為制定有效安全的化療方案以及防治貧血、出血等化療不良反應提供參考。

關鍵詞急性白血病；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；臨床特征

mRNA Expression of Core Molecules in the Downstream of mTOR Pathway and Its Relationship to Clinical Features in Primary Acute Myeloid Leukemia

CHENKejunChengHuiWANGJianminYANGJianminLüShuqing

DepartmentofHematology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

AbstractObjective： To explore the relationship between the mRNA expression of mammalian target of rapamycin (mTOR), eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF-4E) and eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1 (4E-BP1) in bone marrow mononuclear cells of primary acute myeloid leukemia (AML) patients and clinical features of AML. Methods： The mRNA expression levels of 4E-BP1, eIF-4E and mTOR in bone marrow mononuclear cells were detected in 59 patients with primary AML and 15 normal human as a control group by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results： The percentages of mTOR, eIF-4E and 4E-BP1 mRNA high expression in 59 cases of AML were 50.9%, 59.4% and 45.8%, respectively.The platelet count in high 4E-BP1 mRNA expression group was significantly lower than that in low group (P=0.044). The percentage of bone marrow blast cells in high eIF-4E mRNA expression group was higher than that in low group, but there was no significant difference between the two groups (P=0.068). The percentage，and extramedullary invasion of bone marrow blast cells in high mTOR expression group was significantly higher than that in low group(P=0.040，P=0.029).The percentage of anemia in high mTOR expression group was higher than that in low group, but there was no significant difference between the two groups (P=0.082). Conclusions： Core protein mRNA in mTOR pathway downstream were closely relative to the proliferation of bone marrow blast cells, PLT count, anemia and extramedullary invasion in AML. They can help to choose effective and safe chemotherapy regimen, as well as to prevent side effects of chemotherapy such as anemia and bleeding.

Key WordsAcute leukemia;Mammalian target of rapamycin;Clinical features

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是造血干/祖細胞分化過程異常所致的造血系統惡性腫瘤[1]。探索與AML臨床特征及預后相關的分子生物學指標一直是研究熱點。常見的與AML預后良好相關的分子生物學異常類型有t(8；21) /AML1-ETO、inv(16) /CBFβ-MYH11、t(15；17) /PML-RARA等，而與AML預后不良相關的分子生物學改變有MLL重排等。但是，上述融合基因的陽性率較低，并不適用于每位患者的臨床特征及預后的評估。研究發現，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路與細胞的生長、增殖和遷移等密切相關，且在前列腺癌、肺癌、血液系統腫瘤等惡性腫瘤中均有mTOR通路的異常活化[2-4]。

目前國內已有學者[5]檢測了mTOR通路上游核心基因在AML患者骨髓單個核細胞中的mRNA表達水平，但尚無該通路下游基因表達水平的檢測報道。本研究采用RT-PCR檢測了59例初發AML患者mTOR通路下游核心基因的mRNA的表達水平，并分析了其與患者臨床特征的相關性，旨在尋找新的分子生物學指標。

1資料與方法

1.1一般資料收集第二軍醫大學附屬長海醫院血液科2009年11月以來共59例初發AML患者(AML組)骨髓穿刺術后的骨髓標本及相應臨床資料。59例中男性33例，女性26例；年齡<60歲50例，≥60歲9例；有發熱表現者29例，無30例；有貧血者39例，無20例；有出血者41例，無18例；有髓外侵犯者15例，無44例；骨髓原始細胞比例<70% 26例，≥70% 33例；WBC數<50×109/L 45例，≥50×109/L 14例；PLT數<30×109/L 24例，≥30×109/L 35例；誘導方案為IDA方案24例，含DA的方案31例，含HA的方案3例,TA方案1例；45例完全緩解(CR)，14例未緩解(NR)；生存期(0.5個月～69.5個月)。收集15例健康志愿者骨髓穿刺術后的骨髓標本，其中男性9例，女性6例，年齡最小者28歲，最大者46歲。

1.2療效評價參照《血液病診斷及評價標準》[6]進行評價。

1.3方法

1.3.1標本的收集與處理收集每位受檢者的骨髓穿刺液2~3 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入等量磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋。將3~4 mL人淋巴細胞分離液(Ficoll，上海易佰聚經貿有限公司)加入離心管，再將稀釋后的骨髓液沿離心管內壁緩慢加到Ficoll液面上，1800 r/min離心15 min。待離心結束后，輕輕吸取白膜層即單個核細胞層，將其收集到另一離心管中，用PBS液稀釋后離心(1500 r/min，6 min)洗滌2次，去上清液。依次加入細胞培養基1640、小牛血清及二甲基亞砜(6∶3∶1)，須緩緩加入，邊混勻邊加。進行細胞計數后將其分裝入凍存管，置入-80℃冰箱待測。

1.3.2RNA提取及cDNA合成復蘇凍存標本，1500 r/min離心6 min，加入TRIzol試劑(美國Invitrogen 公司)，提取總RNA。然后，加入300 μL三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司)，充分振蕩，室溫靜置5 min，13 000 r/min離心12 min；輕輕吸取上清液到無酶EP管中，加入等量預冷異丙醇(上海凌峰化學試劑有限公司)，顛倒3~5次，室溫靜置5~10 min，13 000 r/min離心12 min；去上清液，加入75%無水乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司)，使RNA懸浮于液體中，13 000 r/min離心5 min；去上清液，待晾干后加DEPC水，溶解RNA；用紫外分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]測RNA的濃度及純度，取光密度值OD260/OD280為1.8~2.1的標本進行后續實驗。取500 ng總RNA，用cDNA試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]以10 μL反應體系進行反轉錄。反應體系如下：Buffer 2 μL，Random primer 0.5 μL，Oligo primer 0.5 μL，M-MLV 反轉錄酶0.5 μL，dNTP混合物1 μL，補超純水至10 μL。反應條件為37℃ 15 min， 85℃ 5 s，產物置于-20℃備用。

1.3.3RT-PCR檢測mRNA表達采用PrimeScriptTMRT試劑盒(大連寶生物工程有限公司)SYBR green法檢測真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF-4E)、eIF4E結合蛋白1(eIF4E binding protein 1，4E-BP1)及mTOR的mRNA表達水平，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)作為內參基因。采用Primer 5.0軟件設計引物。mTOR上游引物：CCAACAGTTCACCCTCAGGT ；下游引物：GCTGCCACTCTCCAAGTTT。4E-BP1上游引物：ATTTAAAGCACCAGCCATCG；下游引物：TGGAGGCACAAGGAGGTAT。eIF4E上游引物：TCTTTAGGAAGGCACGCAGT；下游引物：TTTAGGCCGGGTCAACTATG。GAPDH上游引物： ACCAGCCTCTGGCTTCTACA：下游引物：CCCTAGCTGTGTGCCTTCTC。反應體系如下：mix 7.5 μL，Forward primer 0.5 μL，Reverse primer 0.5 μL， cDNA 0.8 μL， H2O 5.7 μL。反應條件：95℃30 s； 95℃ 5 s， 60℃ 34 s， 40個循環；95℃ 30 s， 60℃ 30 s， 95℃ 15 s。建立PCR產物的熔解曲線。以GAPDH作為內參基因，按2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

2結果

2.1AML組和對照組骨髓單個核細胞中mTOR通路下游基因的mRNA表達水平兩組的單個核細胞中目的基因的mRNA表達水平見表1。根據對照組中各基因的平均表達水平，將AML組中患者相應地分為低表達和高表達組，見表2。

表1　兩組的單個核細胞中目的基因的

表2　AML患者目的基因mRNA的表達情況(n,%)

2.2mTOR通路下游基因mRNA表達水平與AML患者臨床特征間的關系見表3。根據正常人目的基因mRNA表達水平，將AML患者分為低表達組和高表達組。如表3所示，3個目的基因高低表達組在基線指標如性別、年齡等方面無明顯差異，而4E-BP1高表達組PLT數≥30×109/L的比例顯著低于4E-BP1低表達組(46.6% vs 72.4%，P=0.044)；eIF-4E高表達組骨髓原始細胞比例≥70%的比例高于eIF-4E低表達組(65.7% vs 41.6%，P=0.068)；mTOR高表達組骨髓原始細胞比例≥70%的比例高于低表達組(70.3% vs 43.7%，P=0.040)，mTOR高表達組髓外侵犯比例顯著高于低表達組(40.7% vs 12.5%，P=0.029)，mTOR高表達組貧血比例高于mTOR低表達組(77.7% vs 56.2%，P=0.082)。

表3　4E-BP1、eIF-4E及mTOR的mRNA表達水平與AML患者臨床特征的關系

2.3mTOR通路下游基因的mRNA表達水平與AML患者生存情況的關系AML患者骨髓單個核細胞中4E-BP1、eIF-4E、mTOR的mRNA表達水平與患者的生存無明顯相關性。4E-BP1低表達、高表達患者的中位生存期分別為12.5個月、12.0個月，Log Rank=0.891，見圖1A。eIF-4E低表達、高表達患者的中位生存期分別為13.5個月、12.0個月，Log Rank=0.520，見圖1B。mTOR低表達、高表達患者的中位生存期分別為12.5個月、10.0個月，Log Rank=0.654，見圖1C。

圖1　4E-BP1、eIF-4E和mTOR高、低表達組的生存曲線圖

3討論

mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR通路上游主要由磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)組成，下游主要由4E-BP1和核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, P70S6K)組成。通過整合胞外信號，4E-BP1發生磷酸化，使eIF4E-4E-BP1復合體解離，最終eIF-4E結合于mRNA的5′-cap端而促進蛋白翻譯，從而在腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲轉移等方面發揮重要作用[7-8]。本研究的59例AML患者中，4E-BP1、eIF-4E及mTOR mRNA水平高表達者分別占50.9%、59.4%、45.8%。

本研究發現，在AML患者中，4E-BP1 mRNA的高表達與PLT數負相關。這可能是因為，4E-BP1高表達結合的eIF-4E增加，從而使蛋白翻譯受抑，以此起到直接抑制巨核系增殖的作用。因此，AML患者化療前，可根據血小板數，結合骨髓單個核細胞中4E-BP1 mRNA表達水平，綜合評估患者出血風險，以降低病死率。此外，eIF-4EmRNA的高表達可能與骨髓原始細胞增殖正相關，但本研究中eIF-4E高表達組與低表達組的原始細胞比例無統計學意義(P=0.068)，有待增加病例數進行進一步研究。eIF-4E低表達組和高表達組患者的中位生存期無顯著差異。需要說明的是，eIF-4E低表達組中僅1例患者行異基因骨髓移植；而eIF-4E高表達組中有5例行異基因骨髓移植且目前仍存活，很可能移植改善了高表達組的預后。研究[9-10]報道，eIF-4E與肺癌、食管癌等腫瘤的預后不良相關，而阻抑其表達可以抑制細胞增殖及提高化療敏感性。因此，對于eIF-4E在AML患者中高表達是否與預后不良相關，仍不能下定論，尚待進一步研究。本研究還發現，mTOR mRNA的高表達與骨髓原始細胞增殖和髓外侵犯呈正相關。可能原因為，mTOR高表達引起4E-BP1的磷酸化，使得eIF-4E游離并與mRNA的5 -′ cap端結合，促進蛋白翻譯，導致白血病原始細胞不斷增殖、骨髓微環境破壞，致使髓外侵犯增加。目前mTOR已應用于腫瘤的研究及治療中，其抑制劑可以使細胞周期阻滯于G1期，導致細胞增殖受抑、促進細胞凋亡[11]。這提示mTOR可以促進細胞增殖，與我們的研究所得出的結論相似。此外，本研究表明，mTOR mRNA的高表達可能與貧血正相關，可能原因為mTOR促進骨髓原始細胞增殖的同時間接抑制了正常紅系的增殖。因此，如mTOR表達增高，結合骨髓原始細胞比例，可實施較強的化療方案，同時應結合血紅蛋白計數給予積極的輸血支持。

綜上所述，mTOR通路下游核心基因的表達可影響骨髓造血，且與AML原始細胞增殖、髓外侵犯及PLT數密切相關，并可間接影響紅系造血。化療前檢測mTOR通路下游核心基因的表達有助于制定合理強度的化療方案以及進行積極的輸血支持。

參考文獻

[ 1 ]Assouline S, Cocolakis E, Borden KL. The Development of Novel Therapies for the Treatment of Acute Myeloid Leukemia (AML) [J]. Cancers (Basel), 2012 ,4(4):1161-1179.

[ 2 ]Fransecky L, Mochmann LH, Baldus CD. Outlook on PI3K/AKT/mTOR inhibition in acute leukemia[J]. Mol Cell Ther, 2015, 3:2.

[ 3 ]Laplante M, Sabatini DM. mTOR signaling in growth control and disease[J]. Cell, 2012 ,149(2): 274-293.

[ 4 ]Morgan TM, Koreckij TD, Corey E. Targeted therapy for advanced prostate cancer: inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2009, 9(2):237-249.

[ 5 ]秦小琪. PI3K、Akt、mTOR在白血病中的表達及臨床意義[D]. 石家莊：河北醫科大學，2006：10-30.

[ 6 ]張之南.血液病診斷及療效標準[ M] .天津:天津科學技術出版社, 1998:168-373.

[ 7 ]Hay N,Sonenberg N.Upstream and downstream of mTOR[J]. Genes Dev, 2004, 18(16): 1926-1945.

[ 8 ]Richardson CJ, Schalm SS, Blenis J. PI3-kinase and TOR: PIKTORing cell growth[J]. Semin Cell Dev Biol, 2004, 15(2): 147-159.

[ 9 ]Thumma SC, Jacobson BA, Patel MR, et al. Antisense oligonucleotide targeting eukaryotic translation initiation factor 4e reduces growth and enhances chemosensitivity of non-small-cell lung cancer cells. Cancer Gene Ther[J]. 2015, 22(8):396-401.

[10]Lu J, Pan Y, Lei Y, et al. Clinical significance of the expression of eukaryotic initiation factor 4 E and mammalian target of rapamycin in esophageal squamous carcinoma tissues[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi, 2015, 18(9):905-908.

[11]Yu K, Toral-Barza L, Shi C, et al. Biochemical, cellular, and in vivo activity of novel ATP-competitive and selective inhibitors of the mammalian target of rapamycin[J]. Cancer Res, 2009 , 69(15):6232-6240.

中圖分類號R 733.71

文獻標志碼A

通訊作者呂書晴，E-mail: lsq7219@sohu.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：30873042；81100361)