牽張力對大鼠髁突軟骨細胞炎性因子及Hedgehog相關基因的研究①

閆　磊，李善昌，莊亞嚴，張鐵軍，趙　亮(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

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牽張力對大鼠髁突軟骨細胞炎性因子及Hedgehog相關基因的研究①

閆磊，李善昌，莊亞嚴，張鐵軍，趙亮(佳木斯大學附屬口腔醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

摘要:目的：研究牽張力對大鼠髁突軟骨細胞炎性因子及Hedgehog相關基因的影響。方法：體外培育大鼠髁突軟骨細胞，將P1代分為對照、低強度以及高強度3組，分別給予0%、3%以及15%的牽張力作用4h，對比三組軟骨細胞增殖情況、炎性因子及Hedgehog相關基因的變化。結果：培育48h后，對照組無明顯變化，高強度組A450值顯著下降，低強度組A450值顯著上升；給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強度組依次增大，高強度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強度組；低強度組的髁突軟骨細胞Hh表達水平均顯著高于其他兩組，而高強度組Smo的表達顯著低于對照組，以上差異均具有統計學意義(P<0.05)。結論：Hedgehog基因參與了牽張力對軟骨細胞的調控過程，過度的牽張力會抑制軟骨細胞的增殖，誘發炎癥反應。適度的牽張力能夠刺激軟骨細胞，促進軟骨細胞的增殖。

關鍵詞:牽張力；鼠髁突軟骨細胞；炎性因子；相關性

顳下頜關節是人體頜面部唯一的左右雙側聯動關節，具有一定的穩定性和多方向的活動性[1]。下頜在產生咀嚼、吞咽以及語言等功能時需要的生物力學負荷通常由髁突軟骨負擔。此外，下頜骨的生長方向及生長長度也會受到髁突軟骨的影響[2]。Hedgehog(Hh)是能夠編碼一系列分泌蛋白的分節極性基因。有研究報道表明[3]，Hh通路參與牽張力對軟骨細胞的調控過程的可能性十分大。但目前國內對軟骨細胞調控相關研究較少。本文研究牽張力對大鼠髁突軟骨細胞炎性因子及Hedgehog相關基因的影響，以期發現牽引力對顳下頜關節的作用機制。現報道如下。

1材料和方法

1.1試驗動物

Sprague-Dawley(SD)老鼠，雌雄不限，鼠齡為兩周。

1.2研究方法

1.2.1大鼠髁突軟骨的原代培養：在無菌條件下解剖分離大鼠雙側下頜髁突軟骨，剝離去除髁突表面的纖維組織后剪取髁突軟骨，將其剪碎成約1mm3。移入離心管，0.25%胰蛋白酶、37℃消化30min，0.2%膠原酶Ⅱ、37℃消化4h后，200目濾網過濾收集細胞，0.25%錐蟲藍染色，活細胞率大于90%則用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM培養基，在37℃、5%CO2培養箱中孵育，隔天換液，待細胞融合至90%時，胰酶消化，傳代培養，記為P1代細胞。

1.2.2大鼠髁突軟骨的鑒定：將P1代軟骨細胞接種于預先放好爬片的24孔培養板中，培養3d后光鏡下觀察細胞生長狀態，4%多聚甲醛固定后，行甲苯胺藍染色實驗。

1.2.3細胞加力：取P1代軟骨細胞分為3組，接種于Flexcell加力板中，每組3個副孔。待細胞融合至80%時，更換為無FBS的培養基培養24h，使各組細胞狀態同步化后，再更換為含10%FBS的DMEM培養基繼續培養。按加力板使用說明，分別對3組細胞施加0.5Hz，0%(對照組)、3%(低強度組)和15%(高強度組)的牽張應變，作用時間為4h。

1.2.4細胞增殖檢測：加力結束后，每組細胞繼續培養48 h，加入10μL CCK-8溶液，孵育4 h，測定450 nm處的吸光度值(A450)，重復3次，取平均值進行統計分析。

1.2.5Hedgehog相關基因及細胞炎性因子的檢測：提取RNA和反轉錄加力結束后，收集各組細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，置-80℃冰箱保存備用。以cDNA為模板，兩步法進行Real-time PCR反應。PCR產物中分別檢測細胞炎性因子IL-1β、TNF-α，Hedgehog信號通路分子Ihh、Ptc及Smo的基因表達變化。

1.3統計學方法

采用SPSS13.0軟件分析。數據比較以χ2檢驗，計量數據比較以t檢驗，相關性分析選用Spearman法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同程度的牽張力對髁突軟骨細胞增殖能力的影響

培育48h后，對照組無明顯變化，高強度組A450值顯著下降，低強度組A450值顯著上升，三組間差異較大，且差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1　不同程度的牽張力對髁突軟骨細胞

注：t為組內完成細胞加力后與培育48h后對比，F值為三組間相互對比，*P<0.05。

2.2不同程度牽張力對髁突軟骨細胞炎性因子表達的影響

給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強度組依次增大，高強度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強度組，以上差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2不同程度牽張力對髁突軟骨細胞炎性

因子表達的影響

注：F值為三組間相互對比，*P<0.05。

2.3不同程度牽張力對髁突軟骨細胞Hedgehog通路基因表達的影響

給三組不同程度的牽張力后，低強度組的髁突軟骨細胞Hh表達水平均顯著高于其他兩組，而高強度組Smo的表達顯著低于對照組，以上差異均具有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

表3　不同程度牽張力對髁突軟骨細胞Hedgehog

注：F值為三組間相互對比，*P<0.05。

3討論

有相關報道表明[4]，對軟骨細胞給予適合的力學刺激能夠促進軟骨細胞的生長、分化。但力學刺激程度如果較弱甚至沒有，或者過強，則會對軟骨細胞的生長代謝產生較大的抑制作用，導致細胞外基質含量平衡遭到破壞，引起關節軟骨發生退行性病變。Hedgehog基因是一種分節極性基因，參與了力學刺激對軟骨細胞的調控。

本文研究結果顯示，對三組髁突軟骨細胞進行不同程度的牽張力后，各組A450值相差不大，但在培育48h后，對照組無明顯變化，而高強度組A450值顯著下降且遠低于對照組，低強度組A450值顯著上升且遠高于對照組。這提示在牽張力大小為3%作用4h后，軟骨細胞會在接下來的兩天內大量增殖，而若牽引大小為15%則軟骨細胞的增殖會受到很大的抑制。給三組不同程度的牽張力后，三組間IL-1β與TNF-α相差較大，且由對照組到高強度組依次增大，給予15%牽張力的高強度組IL-1β與TNF-α均顯著高于對照組與低強度組。這表明高強度的力學刺激能夠誘導軟骨細胞的炎癥反應，而低強度的效果不明顯。

俞云飛等[5]的研究中表示，牽張力能夠刺激下頜骨髁突增殖層軟骨細胞Hh家族基因表達，從而影響細胞增殖。這與本研究關于不同程度牽張力對髁突軟骨細胞Hedgehog通路基因表達影響的結果相同。給三組不同程度的牽張力后，低強度組的髁突軟骨細胞Hh表達水平均顯著高于其他兩組，而高強度組Smo的表達顯著低于對照組。這提示Hh基因家族對力學刺激十分敏感。Hh信號傳遞受靶細胞膜上兩種受體分別為Ptc和Smo的控制。受體Ptc有腫瘤抑制基因Patched編碼，是有12個跨膜區的單一肽鏈構成，能與配體直接結合，對Hh信號起到負調節作用。綜上所述，Hedgehog基因參與了牽張力對軟骨細胞的調控過程，過度的牽張力會抑制軟骨細胞的增殖，誘發炎癥反應。而適度的牽張力能夠刺激軟骨細胞，促進軟骨細胞的增殖。

參考文獻：

[1]黃圣運，李文剛，張世周，等.微血管吻合器在口腔頜面部缺損重建中的應用[J].中華顯微外科雜志，2015,38(4)：389-391

[2]董瑞，王旭霞，張文娟，等.前牽引頦部反作用力對顳下頜關節影響的三維有限元分析[J].中華口腔醫學雜志，2013,48(12)：740-744

[3]巫云霞，王林，張衛兵，等.擴張力作用下大鼠腭中縫組織成骨現象的連續觀察[J].口腔醫學研究，2010，26(3)：309-311

[4]白明海，吳漢江.牽張力與雌激素對兔鼻軟骨細胞增殖效應調節的初步研究[J].口腔醫學研究，2009，25(4)：412-415

[5]俞云飛，徐宏光，宋俊興，等.力學刺激對軟骨細胞影響研究進展[J].國際骨科學雜志，2012，33(5)：297-299

(收稿日期：2015-01-16)

中圖分類號：R782.6

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)01-0006-02

作者簡介：閆磊(1980～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。通訊作者：趙亮(1981～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。E-mail:28789079@qq.com

基金項目：①黑龍江省衛生計生委科研課題，編號：2014-257。