染料木黃酮通過抑制VEGF表達抑制人口腔癌TCA8113細胞增殖*

戴紅良，　葛樹卿，　楚明會，　梁春光，　王　玥，　賈桂枝

(遼寧醫學院 1護理學院， 2附屬第一醫院口腔科， 3生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121001)

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染料木黃酮通過抑制VEGF表達抑制人口腔癌TCA8113細胞增殖*

戴紅良1△，葛樹卿2，楚明會1，梁春光1，王玥1，賈桂枝3

(遼寧醫學院1護理學院，2附屬第一醫院口腔科，3生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121001)

[摘要]目的： 觀察染料木黃酮對人口腔癌TCA8113細胞增殖的影響，并探討其作用機制。方法: MTT法、細胞計數法及集落形成實驗檢測細胞增殖；蛋白質免疫印跡檢測血管內皮生長因子(VEGF)、細胞外信號調節激酶(ERK)及p-ERK的蛋白水平。結果: 染料木黃酮能顯著抑制TCA8113細胞的增殖，其抗增殖活性具有濃度依賴性；染料木黃酮還可劑量依賴性地降低VEGF、ERK及p-ERK的蛋白水平；VEGF的表達可被ERK特異性抑制劑U0126所抑制；VEGF受體拮抗劑阿西替尼及U0126均顯著抑制TCA8113細胞的增殖。結論: 染料木黃酮可抑制人口腔癌TCA8113細胞的增殖，其機制可能與其抑制ERK表達及活化，進而抑制VEGF的表達有關。

[關鍵詞]染料木黃酮； TCA8113細胞； 細胞增殖； 血管內皮生長因子； 細胞外信號調節激酶

口腔鱗狀細胞癌是最常見的口腔惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的80%以上[1]。在過去的十年間，口腔癌的發生率增加了50%。盡管治療手段不斷改善，患者的5年生存率也只有約50%[2]。而且即使通過手術切除，口腔癌仍存在著較高的局部復發率[3]，患者預后較差。因此，發掘新的治療口腔癌的藥物和方式具有重要的臨床價值和意義。

目前，天然藥物因其低毒高效的特點引起了科研人員的關注[4-5]。染料木黃酮(4’,5,7-三羥基異黃酮)是大豆及其制品中一種含量豐富的植物雌激素。除了其弱雌激素活性外，染料木黃酮還是一種強效的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)抑制劑, 能夠通過對細胞內多種信號分子的調節影響結腸直腸癌[6]、肝癌[7]、肺癌[8]及乳腺癌[9]等各種腫瘤細胞的惡性增殖。除此之外，最近的研究還顯示染料木黃酮對體外培養的人口腔癌TCA8113細胞亦具有顯著的抗增殖活性[10]，但對于其抗口腔癌機理仍需進一步研究。本研究擬從血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)調控角度，探討染料木黃酮對口腔癌的增殖作用及其作用機理。

材料和方法

1材料

人口腔癌TCA8113細胞購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自HyClone；RPMI-1640培養基購自Coring；染料木黃酮(genistein)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]和阿西替尼(axitinib)購于Sigma；RIPA裂解液購自南京諾維贊生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)的 I 抗及辣根過氧化酶標記的 II 抗購自Santa Cruz；VEGF的I 抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

2.1細胞培養人口腔癌TCA8113細胞株以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。用含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化細胞，每3 d傳代 1 次，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2細胞計數檢測細胞增殖取對數生長期的TCA8113細胞以每孔1×105的密度接種于6孔板中。待細胞貼壁后，在37℃、5% CO2培養箱中以不同處理因素在作用TCA8113細胞48 h，0.25% EDTA胰酶消化后進行細胞計數。

2.3集落形成實驗TCA8113細胞以每孔1 000 個的密度接種于6孔培養板，待細胞貼壁后，以0.1% DMSO(對照組)及不同濃度的染料木黃酮作用TCA8113細胞10 d。PBS清洗后，以4%多聚甲醛于室溫固定20 min，再用PBS洗3遍，以結晶紫染色，按下式計算：集落形成率(colony-forming efficiency, CFE)=(集落數/接種細胞數)×100%。

2.4細胞活力檢測取對數生長期的細胞接種于96孔板。待細胞貼壁并實施各種處理后，加入MTT(終濃度為5 g/L)，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育4 h。棄去MTT, 加入150 μL DMSO在37 ℃ 作用10 min并充分振搖直到結晶充分溶解。用酶標儀(Bio-Rad)在波長490 nm時檢測吸光度值。

2.5Western blotting實驗細胞以預冷PBS洗3遍，加入RIPA細胞裂解液 [臨用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)] 提取細胞總蛋白， BCA法測定蛋白濃度。取30 μg總蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳完成后電轉移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜。用1%BSA封閉1 h，接著加待檢測蛋白的I抗4 ℃孵育過夜。TBST充分洗膜后，以HRP標記的II抗室溫孵育2 h。TBST洗膜后，化學發光法顯色。采用Quantity One軟件對條帶灰度進行分析。

3統計學處理

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。數值以均數±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析及兩兩比較的SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1染料木黃酮對TCA8113細胞活力及計數的影響

與對照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細胞48 h后，隨著染料木黃酮濃度的增加，TCA8113細胞活力逐漸降低，細胞數逐漸減少，見圖1。

Figure 1.Proliferation inhibitory effect of different concentrations (0～20 mg/L) of genistein on TCA8113 cells detected by MTT assay (A) and cell counting (B).Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖1不同濃度染料木黃酮對TCA8113細胞增殖的抑制作用

2染料木黃酮對TCA8113細胞集落形成的影響

與對照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細胞10 d后，隨著染料木黃酮濃度的增加，TCA8113細胞集落形成率逐漸降低，當藥物濃度達到20 mg/L時，幾乎沒有集落形成。而且，集落的面積也隨著藥物濃度的增加而減少,見圖2。

Figure 2.The colony-forming efficiency (CFE) of TCA8113 cells after treatment with genistein at different concentrations (0～20 mg/L) for 10 d. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細胞10 d后的細胞集落形成率

3染料木黃酮對TCA8113細胞VEGF表達的影響

與對照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細胞24 h后，TCA8113細胞VEGF的表達水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，表明染料木黃酮具有抑制口腔癌細胞VEGF表達的生物活性，見圖3。

4染料木黃酮對TCA8113細胞ERK表達及活化的影響

與對照組相比，不同濃度染料木黃酮處理TCA8113細胞24 h后，TCA8113細胞總ERK及磷酸化ERK(ERK的活化形式)的水平均隨著藥物濃度的增加而逐漸減弱，表明染料木黃酮可顯著抑制TCA8113細胞ERK的表達及活化，見圖4。

5U0126對TCA8113細胞VEGF表達的影響

如圖5所示，ERK特異性阻斷劑U0126可顯著抑制VEGF的表達，表明基礎狀態下，口腔癌VEGF的表達受到ERK的調控，而染料木黃酮對VEGF表達的抑制作用可能與該物質對ERK的活化抑制有關。

6U0126及阿西替尼對TCA8113細胞增殖的影響

ERK特異性阻斷劑U0126及VEGF受體(VEGFR)拮抗劑阿西替尼均可顯著抑制TCA8113細胞的增殖，表明ERK及VEGF的確參與了TCA8113細胞的增殖，而且VEGF的促增殖活性至少部分是由其受體(VEGFR)介導的。而上述染料木黃酮抗TCA8113細胞增殖的活性很有可能與其對ERK/VEGF信號級聯的抑制有關，見圖6。

討論

口腔癌是世界上第六種最常見的惡性腫瘤之一[11]。據估計，口腔癌的年發病率約為27.5萬[12]。而且，近年來其發病率有逐年增高的趨勢，并具有年輕化發展的趨勢[13-14]。盡管目前口腔癌的診療手段不斷進步，但目前對于其治療仍極為困難，患者預后較差[11]。近些年，人們在以手術和放療的基礎上，逐步引入化學治療，取得了不錯的效果。但與此同時，化療藥物嚴重的毒副作用又大大限制了臨床上對口腔癌的治療[3]。因此，極有必要開發毒副作用小、療效高的抗口腔癌藥物。

Figure 3.The effect of genistein at different concentrations (0～20 mg/L) on the expression of VEGF in the TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3不同濃度染料木黃酮對TCA8113細胞VEGF表達的影響

Figure 4.The effect of genistein at different concentrations (0～20 mg/L) on the expression and activation of ERK in TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4不同濃度染料木黃酮對TCA8113細胞ERK的表達及活化的影響

Figure 5.The effect of U0126 on the expression of VEGF in the TCA8113 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5U0126對TCA8113細胞VEGF表達的影響

Figure 6.Proliferation inhibitory effect of U0126 (10 μmol/L) and axitinib (5 μmol/L) on TCA8113 cells detected by MTT assay (A) and cell counting (B).Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

圖6U0126及阿西替尼對TCA8113細胞增殖的抑制作用

近年來天然物質因其高效低毒的特性受到了越來越多的關注[5,15]。染料木黃酮化學名為4’,5,7-三羥基異黃酮，是在大豆等植物中形成的天然異黃酮類物質，廣泛存在于人們的日常飲食之中[16]。研究證實染料木黃酮具有抑制平滑肌源性泡沫細胞的形成[17]、緩解糖尿病心肌病心肌炎癥和氧化應激[18]及抗腫瘤[7]等多種生物活性。尤其是其抗腫瘤活性更是得到了普遍認同。許多研究證實染料木黃酮對乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、結直腸癌等多種腫瘤均顯示出強大的抗癌活性[19]。本研究發現染料木黃酮能夠劑量依賴性地抑制口腔癌細胞的活力、細胞計數、集落形成率及其集落形成的面積，顯示出染料木黃酮強大的口腔癌增殖抑制活性，這與張群[10]之前的研究報道一致。

血管生成是促進腫瘤細胞生長增殖的重要機制。目前已發現多種參與血管生成的基因，其中VEGF作為強大的血管生成因子，廣泛地表達于包括口腔癌細胞在內的各種癌癥細胞上[20-21]。研究顯示VEGF能促進舌癌中血管的生成，促進舌癌的生長轉移；VEGF靶向干擾則可明顯抑制口腔癌細胞的增殖，促進其凋亡[20]。本研究則進一步證實VEGF的促口腔癌增殖活性可能是由其受體介導的。之前研究報道顯示染料木黃酮可通過抑制腫瘤細胞VEGF的表達抑制各種腫瘤的增殖生長[22]，但尚不清楚該天然物質對口腔癌細胞的抑制作用是否與其對VEGF表達的抑制有關。在本研究中，我們發現不同濃度的染料木黃酮可劑量依賴性地抑制人口腔癌TCA8113細胞VEGF的表達，從而提示染料木黃酮對VEGF的表達的抑制作用可能是其抗口腔癌進展的重要機理。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉導家族的關鍵分子。ERK在許多惡性腫瘤中被異常激活，從而參與細胞的癌變、惡性增殖、侵襲和轉移等[23]。最近研究發現ERK的激活與口腔癌細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關[24-25]。而且，MEK的特異性抑制劑PD184352可劑量依賴性地抑制TCA8113細胞的增殖[26]。上述研究均提示ERK可能是口腔癌化學治療的重要靶點。研究顯示染料木黃酮可通過抑制ERK的活化抑制宮頸癌及肝癌的增殖[7,27]，而對于口腔癌SCC15細胞，染料木黃酮不僅可抑制ERK活化(磷酸化)，還可抑制總ERK的表達[28]。在本實驗中我們利用Western blot發現，與SCC15細胞類似，染料木黃酮對TCA8113細胞ERK的表達及活化均呈現劑量依賴性的抑制作用。ERK促進癌癥進展的關鍵機制之一即是促進VEGF的表達及腫瘤血管化[20]。在本研究中我們發現，ERK特異性阻斷劑U0126亦可顯著抑制TCA8113細胞VEGF的表達。表明口腔癌VEGF的表達及其血管化也是ERK依賴性的。綜上所述，我們推測染料木黃酮可能通過抑制ERK的表達及活化，進而抑制VEGF的表達，從而抑制口腔癌TCA8113細胞的增殖。

口腔癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，患者一般預后較差。而化學合成藥物因其嚴重的毒副作用限制了其療效的發揮。而本研究證實價格低廉、毒副作用小的天然物質染料木黃酮具有顯著的抗口腔癌增殖活性，其抗癌機理可能與其抑制ERK/VEGF信號通路的活化有關。該研究為臨床上嘗試使用該物質進行口腔癌治療提供了實驗和理論依據。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Genistein inhibits proliferation of human oral cancer TCA8113 cells through suppression of VEGF expression

DAI Hong-liang1, GE Shu-qing2, CHU Ming-hui1, LIANG Chun-guang1, WANG Yue1, JIA Gui-zhi3

(1SchoolofNursing，2DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China.E-mail:jy2006hldai@sohu.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of genistein on the proliferation of human oral cancer TCA8113 cells and to explore the underlying mechanisms.METHODS: The cell proliferation was examined by MTT assay, cell counting and colony formation assay. Western blotting was employed to examine the protein levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p-ERK. RESULTS: Genistein significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells in a concentration-dependent fashion. Moreover, genistein dose-dependently decreased the protein levels of VEGF, ERK and p-ERK. The expression of VEGF was also blunted by U0126, a specific inhibitor of ERK. U0126 and axitinib, a VEGF receptor antagonist, both significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells. CONCLUSION: Genistein inhibits the proliferation of TCA8113 cells, which may be related to its inhibitory effect on ERK expression and activation, thus subsequently decreasing the expression of VEGF.

[KEY WORDS]Genistein; TCA8113 cell; Cell proliferation; Vascular endothelial growth factor; Extracellular signal-regulated kinase

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.013

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

通訊作者△Tel: 0416-4673688； E-mail: jy2006hldai@sohu.com

*[基金項目]遼寧省自然科學基金(聯合基金)資助項目(No. 2013022037)；遼寧醫學院校長基金-奧鴻博澤大學生科技創新基金資助項目(No. 2015D20)

[收稿日期]2015- 10- 10[修回日期] 2015- 12- 09

[文章編號]1000- 4718(2016)03- 0464- 06

雜志網址： http://www.cjpp.net