杏鮑菇甲殼素對大鼠實驗性脂肪肝的預(yù)防作用

黃家福，林嬌芬，歐一新，劉靜娜，曹 娜，莊詩怡，潘秋瑜，潘裕添（閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建 漳州 363000）

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杏鮑菇甲殼素對大鼠實驗性脂肪肝的預(yù)防作用

黃家福，林嬌芬，歐一新，劉靜娜，曹 娜，莊詩怡，潘秋瑜，潘裕添*
（閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建 漳州 363000）

摘 要：為研究杏鮑菇甲殼素對脂肪肝的預(yù)防作用，采用給脂肪肝模型大鼠對其喂食不同濃度杏鮑菇甲殼素，以考來烯胺為陽性對照，飼養(yǎng)5 周后觀察其血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglycerides，TG）水平，肝臟組織中的TC、TG、丙二醛（malonaldehyde，MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及肝組織病理學(xué)變化情況。結(jié)果表明：杏鮑菇甲殼素能極顯著性（P＜0.01）地降低大鼠血清中ALT、AST、TC、TG水平，顯著提高肝臟組織中SOD活性（P＜0.05）、降低MDA活性，減輕肝組織脂肪性樣變，減少TC、TG在肝組織中積累，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，并值得注意的是，與考來烯胺組相比，杏鮑菇甲殼素高劑量組的預(yù)防效果與之相近，無差異性（P＞0.05）。結(jié)論：杏鮑菇甲殼素具有預(yù)防脂肪肝形成的作用。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇；甲殼素；實驗性脂肪肝；預(yù)防

引文格式：

黃家福,林嬌芬,歐一新,等.杏鮑菇甲殼素對大鼠實驗性脂肪肝的預(yù)防作用[J].食品科學(xué),2016,37(5):219-222.

HUANG Jiafu,LIN Jiaofen,OU Yixin,et al.Preventive effect of chitin from Pleurotus eryngii on fatty liver in rats[J].Food Science,2016,37(5):219-222.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605039.http://www.spkx.net.cn

甲殼素是2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖單體通過β-1,4糖苷鍵相連的線性多糖，也是自然界中少見的一種帶正電荷的堿性多糖，廣泛存在于昆蟲類、水生甲殼類的外殼和菌類、藻類的細胞壁中[1]。具有無毒性、親水性、生物相溶性、生物可降解性、抗菌性等特點，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)用材料[2-3]、生物醫(yī)藥[4-5]、生物農(nóng)藥[6-7]、保健食品[8-9]、環(huán)保[10-11]、復(fù)合材料[12-14]等領(lǐng)域。

隨著經(jīng)濟高速發(fā)展，人民生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)隨之發(fā)現(xiàn)相應(yīng)改變，脂肪肝的發(fā)病率也呈快速持續(xù)上升的趨勢。脂肪肝可分為酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝，后者又根據(jù)其病因分為肥胖性脂肪肝、高脂血癥性脂肪肝、糖尿病性脂肪肝、營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝、藥物性脂肪肝等[15]。非酒精性脂肪肝并不是一種良性及靜止的病變，它可在較短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損害，進一步發(fā)展為脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、脂肪性肝硬化[16]。目前，國內(nèi)外尚未有理想預(yù)防脂肪肝的藥物，然而，據(jù)Neyrinck[17]和Zacour[18]等的報道，甲殼素可以減少熱量的攝入以及甘油三酯在肝臟中積累，并且可以抑制血脂水平，而且本研究中的甲殼素來自于杏鮑菇，其蛋白質(zhì)、灰分、砷等含量較低，有別于蝦蟹殼來源的甲殼素。基于前者的研究基礎(chǔ)上，本課題組通過建立高脂血癥性脂肪肝模型，觀察杏鮑菇甲殼素預(yù)防脂肪肝形成的作用，為開發(fā)天然藥物和功能食品、拓展傳統(tǒng)的杏鮑菇產(chǎn)業(yè)鏈提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

48 只清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，體質(zhì)量（100±20） g，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證編號：2007000546954，環(huán)境溫度（22±2） ℃，每日光照12 h，分籠飼養(yǎng)，自由取食和飲水，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d。

高脂飼料（質(zhì)量分數(shù)為78.8%，下同）：基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽鹽，基礎(chǔ)飼料 上海斯萊克實驗動物有限公司。

杏鮑菇甲殼素（Pleurotus eryngii chitin，PC）閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)物工程技術(shù)中心實驗室；考來烯胺 南京厚生藥業(yè)有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglycerides，TG）試劑盒 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2儀器與設(shè)備

UV-1100紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；PRO200組織勻漿器 美國Pro Scientific公司；超低溫冰箱 美國Thermo公司；高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；生物相差數(shù)碼顯微鏡 日本Olympus公司；電子分析天平 日本Shimadzu公司；全自動生化分析儀 邁瑞生物醫(yī)療公司；組織切片機 德國Slee公司；EG1150組織包埋機、組織脫水機 德國Leica公司；漩渦振蕩器 Minishaker公司。

1.3方法

1.3.1分組與給藥

取適應(yīng)環(huán)境后的雄性SD大鼠48 只，隨機分為6 組，每組8 只，設(shè)正常組、模型組、考來烯胺組、PC高劑量組、PC中劑量組、PC低劑量組，除正常組給予基礎(chǔ)飼料外，模型組等5 組均飼以高脂飼料，同時考來烯胺組（1 g/（kg·d））、PC高劑量組（1 g/（kg·d））、PC中劑量組（0.5 g/（kg·d））、PC低劑量組（0.25 g/（kg·d））按體質(zhì)量比（10 mL/kg）灌胃給藥，正常組、模型組給予同等劑量的質(zhì)量分數(shù)為0.2%羧甲基纖維素鈉，每日1 次，連續(xù)給藥5 周后。每天觀察大鼠生活狀況，定時稱質(zhì)量，記錄進食情況，并于每天19：00灌胃給藥，給藥前2 h禁食[19-20]。

1.3.2觀察指標及測定方法

末次給藥后，禁食禁水12 h，稱體質(zhì)量，尾靜脈取血，3 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，采用全自動生化儀測測血清中TG、TC、AST、ALT含量，頸椎脫臼處死，取肝臟，稱質(zhì)量，取肝左小葉置10%的福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、4 μm切片，進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，肝右小葉置液氮保存，測肝臟組織中的TC、TG、MDA含量，SOD活性及計算肝臟指數(shù)。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1經(jīng)甲殼素處理后各組大鼠肝組織病理變化

2.1.1肉眼觀察結(jié)果

圖1　各組大鼠肝臟外觀變化Fig.1 Change in appearance of liver tissue of rats from each group

由圖1可知，正常組肝色鮮紅、邊緣銳利、質(zhì)韌，有光澤且富有彈性；模型組肝臟體積明顯增大，包膜緊張、邊緣圓鈍、整個肝臟呈奶黃色，并見局灶性黃白色變性灶，切面油膩；考來烯胺組肝臟色偏黯紅、質(zhì)軟、表面光滑、邊緣銳利；PC各劑量組（圖1D、E、F）情況有不同程度的好轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

2.1.2組織病理學(xué)觀察結(jié)果

圖2　各組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（×40000）Fig.2 Change in histopathological characteristics of liver of rats from each group(× 400)

由圖2可知，正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇清晰可見、肝索排列整齊、肝細胞無脂肪變性、肝組織內(nèi)無脂肪空泡。模型組大鼠肝小葉邊界模糊不清、肝索排列紊亂、肝竇消失、肝細胞極度腫脹呈圓形、胞漿內(nèi)充滿脂肪空泡，出現(xiàn)組織重度脂肪變性。考來烯胺組中肝組織結(jié)構(gòu)正常、肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝細胞無脂肪變性、肝組織內(nèi)無脂肪空泡，但肝細胞腫脹。PC低劑量組中大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，但出現(xiàn)脂肪變性、有少量的脂肪空泡，PC中劑量組和高劑量組較PC低劑量組更進一步好轉(zhuǎn)，較考來烯胺組略有好轉(zhuǎn)，與正常組相似。

2.2經(jīng)甲殼素處理后大鼠血脂、肝功能變化

由表1可知，經(jīng)甲殼素處理5 周后，相對模型組，甲殼素處理組大鼠的血脂有極顯著下降（P＜0.01），并且呈現(xiàn)劑量關(guān)系，如模型組血清中的TC濃度為（2.72±0.17） mmol/L，PC高、中、低劑量組的TC水平分別為（2.01±0.12）、（2.21±0.34）、（2.26±0.09） mmol/L；PC處理組大鼠的肝功能也有極顯著下降（P＜0.01），如模型組血清中的ALT含量為（119.76±10.80） U/L，PC高、中、低劑量組的ALT含量分別為（62.17±10.30）、（73.67±8.89）、（73.98±4.98） U/L，并且與考來烯胺相比較，PC高劑量組中的TC、TG、ALT、AST含量無顯著性差異，預(yù)防效果相近。

表1　PC對大鼠血脂和肝功能的影響Table 1 Effect of PC on blood lipids and liver function in rats

2.3經(jīng)PC處理后大鼠肝脂、肝臟指數(shù)、肝組織中相關(guān)酶酶活性變化

與模型組相比，PC可以顯著性提高由于脂質(zhì)代謝紊亂所造成的低SOD活性、降低高MDA含量，并減少TC和TG在肝臟組織中沉積，降低肝臟指數(shù)（表2），PC處理組中大鼠肝臟中TC、TG含量極顯著下降（P＜0.01），SOD活性極顯著性升高（P＜0.01），MDA顯著性降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)顯著性降低（P＜0.05），相比之下，PC高劑量組的預(yù)防效果與考來烯胺的相近，無顯著性差異。

表2　PC對大鼠肝臟中TC、TG、SOD、MDA及肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of PC on liver index,TC,TG,SOD and MDA in rats

3　討 論

脂肪性肝病簡稱為脂肪肝，是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病，同時也是多種肝臟疾病發(fā)展中的一種病理過程，是最常見的彌漫性肝病之一，其以肝細胞內(nèi)甘油三酯蓄積過多為主要病理改變，當肝細胞內(nèi)脂肪堆積過多，脂肪含量超過肝濕質(zhì)量的5%，或組織學(xué)上每單位面積見1/3以上肝細胞脂變時，稱為脂肪肝[15,21]。

肝臟是脂肪代謝的重要場所，當進行高脂飲食時，體內(nèi)外源性脂肪增多、肝細胞酯化形成TG增多、血漿中TG降解減少、流入肝臟的TG增加，由于過量攝入膽固醇、游離脂肪酸會產(chǎn)生細胞毒性，使肝細胞功能受損，肝細胞轉(zhuǎn)運TG能力下降，則表現(xiàn)為肝功能異常、血清中TC、TG水平異常升高[22-23]。在本實驗中，SD大鼠用高脂飼料飼養(yǎng)，模型組大鼠血清中TC、TG、ALT、AST水平均較正常組極顯著升高（P＜0.01），但經(jīng)喂食5 周的PC預(yù)防處理，PC各劑量組大鼠的血脂（TC、TG）水平有顯著性下降，肝功能（ALT、AST）明顯恢復(fù)，且PC高劑量組的預(yù)防效果與考來烯胺組相近，PC的預(yù)防效果呈現(xiàn)劑量關(guān)系。

脂肪肝的確切發(fā)病機理尚未明確，通常以為是肝細胞脂肪合成增加和氧化減少所致，本研究結(jié)果中，模型組肝組織中MDA含量均較正常組明顯升高，SOD活性均較正常組明顯降低（P＜0.01），表明模型組大鼠肝細胞耗氧量明顯增加，體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，致使其反應(yīng)產(chǎn)物MDA增多。經(jīng)喂食PC 5 周，PC中劑量組和高劑量組均能極顯著提高肝臟組織中SOD活性（P＜0.01），PC各處理組均能顯著抑制MDA過度增多（P＜0.05），且肝臟指數(shù)隨劑量的增加而降低，這與張軍等[24]所報道的相一致，甲殼素可以提高SOD活性，降低MDA含量。

綜上所述，PC具有清除機體自由基、增強抗氧化能力的作用，可以調(diào)節(jié)和改善自由基代謝平衡，增加脂肪代謝減少其在肝臟組織中的積累，從而起到預(yù)防脂肪肝的形成。

參考文獻：

[1]蔣挺大.甲殼素[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,1996:1-4.

[2]PARK S Y,PARK J C,KIM M S,et al.Differential effect of watersoluble chitin on collagen synthesis of human bone marrow stem cells and human periodontal ligament stem cells[J].Tissue Engineering:Part A,2015,21(3/4):451-462.DOI:10.1089/ten.TEA.2014.0156.Epub 2014 Oct 2.

[3]VENKATESAN J,VINODHINI P A,SUDHA P N,et al.Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration[J].Advances in Food and Nutrition Research,2014,73:59-81.DOI:10.1016/B978-0-12-800268-1.00005-6.

[4]BOUHENNA M,SALAH R,BAKOUR R,et al.Effects of chitin and its derivatives on human cancer cells lines[J].Environmental Science andPollution Research,2015,22(20):15579-15586.DOI:10.1007/s11356-11015-14712-11353.

[5]LIM S C,LEE K M,KANG T J.Chitin from cuttlebone activates inflammatory cells to enhance the cell migration[J].Biomolecules & Therapeutics,2015,23(4):333-338.DOI:10.4062/biomolther.2015.062.Epub 2015 Jul 1.

[6]YOUNES I,HAJJI S,FRACHET V,et al .Chitin extraction from shrimp shell using enzymatic treatment.Antitumor,antioxidant and antimicrobial activities of chitosan[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,69:489-498.DOI:10.10 16/j.ijbiomac.2014.06.013.Epub 2014 Jun 17.

[7]SHANTHI MARI L S,JAGRUTHI C,ANBAZAHAN S M,et al.Protective effect of chitin and chitosan enriched diets on immunity and disease resistance in Cirrhina mrigala against Aph anomyces invadans[J].Fish & Shellfish Immunology,2014,39(2):378-385.DOI:10.1016/j.fsi.2014.05.027.Epub 2014 May 27.

[8]GHOTLOO S,HOSEINI M H,ALIMOHAMMADIAN M H,et al.Immunomodulatory effects of chitin micropa rticles on Leishmania major-infected BALB/c mice[J].Parasitology International,2015,64(2):219-221.DOI:10.1016/j.parint.2014.12.007.Epub 2014 Dec 24.

[9]van DYKEN S J,MOHAPATRA A,NUSSBAUM J C,et al.Chitin activates parallel immune modules that direct distinct inflammatory responses viainnate lymphoid type 2 and gammadelta T cells[J].Immunity,2014,40(3):414-424.DOI:10.1016/j.immuni.2014.02.003.Epub 2014 Mar 13.

[10]KIELAK A M,CRETOIU M S,SEMENOV A V,et al.Bacterial chitinolytic communities respond to chitin and pH alteration in soil[J].Applied and Environmental Microbi ology,2013,79(1):263-272.DOI:10.1128/AEM.02546-12.Epub 2012 Oct 26.

[11]JACQUIOD S,FRANQUEVILLE L,CECILLON S,et al.Soil bacterial community shifts after chitin enrichment:an integrative metagenomic approach[J].PLoS ONE,2013,8(11):e79699.DOI:10.1371/journal.pone.0079699.eCollection 2013.

[12]NGUYEN V Q,ISHIHARA M,KINODA J,et al.Development of antimicrobial biomaterials produced from chitin-nanofi ber sheet/silver nanoparticle composites[J].Journal of Nanobiotechnology,2014,12:49-57.DOI:10.1186/s129 51-014-0049-1.

[13]NASERI N,ALGAN C,JACOBS V,et al.Electrospun chitosan-based nanocomposite mats reinforced with chitin nanocrystals for wound dressing[J].Carbohydrate Polymers,2014,109:7-15.DOI:10.1016/j.carbpol.2014.03.031.Epu b 2014 Mar 26.

[14]KUO Y C,LIN C C.Accelerated nerve regeneration using induced pluripotent stem cells in chitin-chitosan-gelatin scaffolds with inverted colloidal crystal geometry[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,103:595-600.DOI:10.1016/j.colsurfb.2012.11.001.Epub 2012 Nov 9.

[15]呂瑞娟,任登先,閆明.脂肪肝的發(fā)病機理和治療研究進展[J].甘肅科學(xué)學(xué)報,2001,13(2):57-64.DOI:10.3969/j.issn.1004-0366.2001.02.015.

[16]萇新明,贠建蔚.脂肪性肝病防治的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(35):3573-3578.DOI:10.3969/j.issn.1009-3079.2009.35.001.

[17]NEYRINCK A M,POSSEMIERS S,VERSTRAETE W,et al.Dietary modulation of clostridial cluster XIVa gut bacteria(Roseburia spp.)by chitin-glucan fi ber improves host metabolic alterationsinduced by high-fat diet in mice[J].Journal of Nutritional Biochemistry,2012,23(1):51-59.DOI:10.1016/j.jnutbio.2010.10.008.Epub2011Mar 15.

[18]ZACOUR A C,SILVA M E,CECON P R,et al.Effect of dietary chitin on cholesterol a bsorption and metabolism in rats[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology,1992,38(6):609-613.

[19]王赫,楊良月,曹曉東,等.SD大白鼠高脂血癥及脂肪肝模型的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(3):172-174; 235.

[20]鐘嵐 ,范建高,王國良,等.肥胖、高脂血癥性脂肪性肝炎模型的建立[J].實驗動物科學(xué)與管理,2000,17(2):16-20.

[21]劉麗萍.他汀類藥物在脂肪性肝病治療中的應(yīng)用[J].藥品評價,2013,10(1):21-24; 46.DOI:10.3969/j.issn.1672-2809.2013.01.007.

[22]衣桂燕,楊庭樹,李云芝,等.普羅布考和阿托伐他汀聯(lián)合用藥對高脂飲食自發(fā)性高血壓大鼠肝臟的影響[J].中國動脈硬化雜志,2009,17(2):117-121.

[23]董春富,吳國華.脂肪肝患者血脂、肝功能指標改變的分析[J].檢驗醫(yī)學(xué),2005,20(2):160-161.DOI:10.3969/j.issn.1673-8640.2005.02.025.

[24]張軍,韓春濤,邵紅.關(guān)于短跑運動員服用甲殼素影響運動能力的研究[J].哈爾濱體育學(xué)院學(xué)報,2006,24(1):115-117.DOI:10.3969/j.issn.1 008-2808.2006.01.048.

Preventive Effect of Chitin from Pleurotus eryngii on Fatty Liver in Rats

HUANG Jiafu,LIN Jiaofen,OU Yixin,LIU Jingna,CAO Na,ZHUANG Shiyi,PAN Qiuyu,PAN Yutian*
(Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China)

Abstract:An experimental rat model of fatty liver was constructed to explore the preventive effect of chitin from Pleurotus eryngii on fatty liver.The rats were fed chitin at various concentration levels while cholestyramine was used as a positive control.After 5 weeks,the levels of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST),total cholesterol(TC)and total triglycerides(TG)in serum and the levels of malonaldehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in liver were detected and pathological changes in liver were examined.Results showed the levels of ALT,AST,TC and TG in serum and the levels of TC,TG and MDA in liver significantly decreased(P < 0.01),and SOD activity significantly increased(P < 0.05)after administration with P.eryngii chitin for 5 weeks.Moreover,fatty degeneration in liver tissue was alleviated,and the levels of TC and TG were reduced in liver tissue.Furthermore,the hepatoprotective activity of P.eryngii chitin(PC)was dose dependent.Notably,the preventive effect of high-dose PC was similar to that of cholestyramine(P < 0.05).All these results indicated that P.eryngii chitin has the potential to prevent fatty liver disease in rats.

Key words:Pleurotus eryngii; chitin; experimental fatty liver; prevention

中圖分類號：Q539.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0219-04

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605039 10.7506/spkx1002-6630-201605039.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：潘裕添（1969—），男，教授，學(xué)士，研究方向為天然產(chǎn)物。E-mail：xmpyt@sina.com

作者簡介：黃家福（1982—），男，講師，碩士，研究方向為微生物次生代謝產(chǎn)物。E-mail：dongxie1982@126.com

基金項目：2015年福建省科技廳引導(dǎo)性項目（2015N0030）；福建省自然科學(xué)基金指導(dǎo)性計劃項目（2012D137）；福建省自然科學(xué)基金青年創(chuàng)新項目（2015J05071）；2014年福建省教育科研項目一般項目（JA14205）

收稿日期：2015-08-24