重組腺病毒p27kip1誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的初步研究

蔣福剛　王天易　李　軍　熊青榮

解放軍第一八一醫(yī)院　1)神經(jīng)外科　2)影像中心　桂林　541002

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重組腺病毒p27kip1誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的初步研究

蔣福剛1)王天易1)李軍1)熊青榮2)△

解放軍第一八一醫(yī)院1)神經(jīng)外科2)影像中心桂林541002

【摘要】目的研究重組腺病毒介導(dǎo)的p27kip1體外對U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。方法構(gòu)建p27kip1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞為實驗組，并設(shè)正常對照組、空載體組，采用Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達；采用Real time PCR法檢測相關(guān)基因的表達；采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果Western blot 和Real time PCR結(jié)果均顯示，實驗組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染72 h后，可見Bcl-2表達降低，同時Bax、Caspase3和Fas-L表達增強；流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒后能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。結(jié)論p27kip1在體外能夠抑制U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】p27kip1；膠質(zhì)瘤；腺病毒；細(xì)胞凋亡

膠質(zhì)瘤是最普遍的原發(fā)性腦腫瘤，我國膠質(zhì)瘤的發(fā)病率及病死率居世界前列，因此，對腦膠質(zhì)瘤的研究極為重要。腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移與癌細(xì)胞的增殖有著密切關(guān)系，而許多癌基因和抑癌基因都直接參與了癌細(xì)胞的生長[1-2]。因此，研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因至關(guān)重要。p27Kip1是1994年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，有研究表明P27kip1的表達隨人腦膠質(zhì)瘤級別的升高而降低，在膠質(zhì)瘤的浸潤、遷移和腫瘤抑制中可能有調(diào)節(jié)作用[3-4]。因此，p27kip1表達下調(diào)或缺失與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。本研究用重組腺病毒介導(dǎo)的p27kip1基因，觀察對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響，并初步探討了p27kip1的抑瘤機制，為臨床診斷、治療提供理論依據(jù)。

1材料

U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞購于sigma公司。一抗：小鼠抗人p27kip1、Bcl-2、Bax、Caspase3和Fas-L抗體購于Santa公司，二抗：辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋ZB-2301。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，2×Taq PCR Master Mix，TRNzol總RNA提取試劑盒均購自北京天根。引物均由上海生工生物有限公司合成。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于羅氏公司。

2方法

2.1p27kip1過表達腺病毒載體構(gòu)建根據(jù)人p27kip1基因的cDNA片段，設(shè)計引物如下：p27kip1-1：5' ggcgctttgttttgttcggtttt 3'；p27kip1-2：5' ccccgctccacgtcagttcct 3' 1006 bp；選取野生型基因組DNA樣本，采用高保真酶進行PCR擴增后，連T載體，測序鑒定。將測序正確的模板亞克隆至AdTrack穿梭載體，PmeI線性化后在BJ5183細(xì)菌中重組，挑選正確的重組子，大量擴增質(zhì)粒。包裝：采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染介導(dǎo)試劑，用PacⅠ酶切后的pAdeasy-Adtrack-p27kip1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，具體按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。

2.2Western blot及Real time PCR法檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達的影響(1)細(xì)胞處理：實驗組：采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染介導(dǎo)試劑，用包裝好的p27kip1腺病毒轉(zhuǎn)染U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，具體操作按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行；空載體組：將pAdeasy-Adtrack空載體按前面方法轉(zhuǎn)染U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞；正常對照組：未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收集保存。(2)Western blot法：收集細(xì)胞加蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA法檢測胞總蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，13 V(恒壓)過夜，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，分別加入小鼠抗人p27kip1、Bcl-2、Bax、Caspase3和Fas-L抗體室溫反應(yīng)2 h，山羊抗小鼠IgG二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色。用Gel-ProAnalyzer3.2圖像分析軟件分析條帶灰度值。(3)Real time PCR：收集細(xì)胞采用異硫氰酸胍/苯酚法提取總RNA(TRNzol總RNA提取試劑盒)，紫外分光光度儀測RNA純度及濃度。用2 μgRNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄，加樣體系如下：RNA Ace 0.5 μL，RNAase Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dt) 1 μL，dNTPs 2 μL，5×RT buffer 4 μL，2 μgRNA，補1‰DEPC水至20 μL；反應(yīng)條件如下：42 ℃ 10 min，30 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。Real time PCR加樣體系如下：2×SYBRGreen10 μL，上下游引物各0.3 μL，cDNA 2 μL，補無菌雙蒸水至20 μL。加完樣后上熒光定量PCR儀反應(yīng)。條件如下：94 ℃ 5 min，(94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)40 cycles，72 ℃ 10 min。基因引物序列如下(表1)。

表1　基因引物序列

2.3流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響取對數(shù)生長期的SFs(懸浮生長細(xì)胞)進行實驗。(1)細(xì)胞處理及分組:以1×106/mL接種對數(shù)生長期經(jīng)s100A4 siRNA轉(zhuǎn)染的SFs細(xì)胞于37 ℃、5% CO2與飽和濕度下培養(yǎng)24 h，與48 h各一組，相同條件下培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作對照。(2)DNA含量分析法：收集細(xì)胞，添加適量4 ℃預(yù)冷PBS，混勻、1 000 r/min，離心5 min，棄上清，12 mm×75 mm離心管中加0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)具體操：4 ℃預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞(1×106)24～72 h；3 500 r/min，離心5 min，棄上清；1 mL PBS重懸細(xì)胞，3 500 r/min，離心5 min，棄上清；重復(fù)一次；120～150 μL RNAase，37 ℃孵育40 min；150～200 μL PI，4 ℃孵育2 h；上機檢測；Modfit LT for Mac。

3結(jié)果

3.1PCR擴增目的片段p27kip1見圖1。

圖1　PCR擴增結(jié)果

注：第1泳道為:Maker DL2000， 從上到下 2000、1000、750、500、250、100 bp；第2泳道為: p27kip1目的條帶，1 000 bp左右，與預(yù)期大小吻合，回收目的條帶

3.2 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白表達的影響Western blot檢測顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒組的Bcl-2蛋白表達有所降低，而BAX、Caspase3和Fas-L蛋白的表達有所升高；轉(zhuǎn)染空載體組蛋白表達無明顯差異(圖2)。結(jié)果說明p27kip1可以促進人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

圖2Western blot檢測結(jié)果

注：上樣順序從左到右分別為：轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒組、空載體組、對照組

3.3Real time PCR法檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)因子基因表達的影響Real time PCR檢測顯示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒組的Bcl-2的mRNA相對表達倍數(shù)有所降低，而BAX、Caspase3和Fas-L的mRNA相對表達倍數(shù)有所升高(表2)；轉(zhuǎn)染空載體組mRNA相對表達倍數(shù)無明顯差異。p27kip1可以促進人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

表2　Real time PCR檢測結(jié)果

注：與正常細(xì)胞組比，*P<0.05

3.4流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響見圖3、圖4。

圖3　未轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期

圖4　轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期

流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞(圖3)相比，轉(zhuǎn)染p27kip1腺病毒的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受抑(圖4)，說明p27kip1對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。

4討論

由于膠質(zhì)瘤的侵襲特點，即使采取輔助治療，復(fù)發(fā)也很普遍，嚴(yán)重威脅患者的身體健康。靶向治療正越來越引起注意。真核生物細(xì)胞周期的調(diào)控有賴于細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)的活性，P27 Kip1蛋白是一種CDK抑制劑，具有限制性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進程的作用[4]。雖然p27Kip1在腦膠質(zhì)瘤中的抑癌作用和機制仍存在較大爭議[5]，但作為細(xì)胞分裂周期中的一個非常重要的負(fù)性調(diào)節(jié)物，在研究細(xì)胞周期調(diào)

控中，p27Kip1越來越受到重視。本研究Western blot和Real time PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了pAdeasy-Adtrack-p27kip1重組質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)基因Bcl-2表達降低，同時Bax、Caspase3和Fas-L表達增強，說明p27kip1表達的增加對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期受到影響。流式細(xì)胞檢測結(jié)果也顯示轉(zhuǎn)染了p27kip1重組質(zhì)粒的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受到抑制，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。這一結(jié)果也與趙斌杰等[6]研究相似，表明p27kip1的表達對星形膠質(zhì)瘤增生活性起抑制作用。故對p27kip1基因的深入研究和深入探討在膠質(zhì)瘤的防治方面具有重要意義。

5參考文獻

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[2]Wang L，Zhang B，Xu X，et al.Clinical significance of FOXP3 expression in human gliomas[J].Clin Transl Oncol，2014，16(1):36-43.

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[6]趙斌杰，趙洪洋，戢翰升，等.重組腺病毒介導(dǎo)的P27kip1基因治療大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的實驗研究[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2006，(3):160-163.

(收稿2015-05-11)

【中圖分類號】R730.264

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)05-0027-03

通訊作者：△熊青榮，E-mail:yibayi@sina.com