高血壓腦出血血腫周圍C反應蛋白變化與凋亡細胞的關系

常海剛　王雅瀟　馬鵬舉　周　祥　惠　磊　徐　翀　周文科　金保哲(通訊作者)

新鄉醫學院第一附屬醫院　衛輝　453100

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高血壓腦出血血腫周圍C反應蛋白變化與凋亡細胞的關系

常海剛王雅瀟馬鵬舉周祥惠磊徐翀周文科金保哲(通訊作者)

新鄉醫學院第一附屬醫院衛輝453100

【摘要】目的探討高血壓腦出血患者血腫周圍C反應蛋白表達及與細胞凋亡的關系。方法選取20例高血壓腦出血患者血腫灶周圍腦組織標本為實驗組，5例手術通道血腫遠隔部位腦組織標本為對照組。根據腦出血量大小實驗組標本分為3組A(出血量35～45 mL)、B(出血量45～70 mL)、C(出血量≥70 mL)組。所有標本均行TUNEL染色、C反應蛋白免疫組化染色。對資料進行統計學相關分析。結果實驗組血腫周圍腦組織都有不同程度TUNEL陽性凋亡細胞和C反應蛋白陽性細胞；越遠離血腫周圍，對照組TUNEL陽性細胞和C反應蛋白陽性細胞表達減少，同時血腫量較大者，血腫周圍TUNEL陽性細胞和C反應蛋白表達更為顯著。結論腦出血血腫周圍腦組織大量表達C反應蛋白，TUNEL陽性凋亡細胞亦較明顯，而血腫遠隔部位CRP不表達或僅少量表達，TUNEL陽性細胞表達亦減少，CRP可能直接參與腦出血血腫周圍腦組織細胞凋亡過程。

【關鍵詞】C反應蛋白；腦出血；細胞凋亡

腦出血是神經科常見病、多發病，是一種最具破壞性的腦血管病，占所有腦卒中的15%，其發病率、致殘率、復發率及病死率均較高[1]，且預后極差[2-3]。近年來，隨著腦血管病患者數的不斷上升，腦血管病已成為威脅人類健康的首發疾病，腦血管病變的診治日益受到重視。研究表明，腦出血后出血部位和周圍組織存在炎性反應，是腦出血后繼發性腦損害病理生理的重要環節[4-5]。C反應蛋白(CRP)為一種反映各種急慢性炎癥的時相蛋白[6]，正常情況存在于血清或血漿中，機體在急性炎癥或創傷時，體內炎性反應系統被激活，CRP水平顯著升高[7-8]。研究證實CRP是與動脈粥樣硬化的發生、演變進展有關的促炎因子[9]，可預測未來心腦血管事件的發生。它在冠心病、腦梗死、周圍血管栓塞等疾病診斷和預測中發揮越來越重要的作用，甚至被認為是心、腦血管病危險評估的金標準[10]。大量研究也證實，在自發性腦出血患者中，血清CRP增高并和患者預后有密切相關性，以往研究主要集中在全身及血清中CRP的表達，而對腦組織中CRP參與病理生理直接證據較少，尤其對自發性腦出血血腫周圍的CRP表達及與細胞凋亡關系等研究更少。本文旨在研究高血壓腦出血血腫周圍CRP表達及其與細胞凋亡關系。

1資料與方法

1.1一般資料研究對象為新鄉醫學院第一附屬醫院收治手術患者20例，男12例，女8例，年齡38～65歲，平均50歲。家屬簽署知情同意書。

1.2診斷標準符合1995年第4屆腦血管會議修訂的腦出血診斷標準。排除標準：發病前4周內出現潛在的感染、創傷、手術史、放化療及抗炎藥物治療史；糖尿病、肝腎疾病、肺結核、慢性阻塞性肺疾病、心功能衰竭、自身免疫性疾病。所有患者行CT檢查，測量血腫量，出血量計算采用多田方法T=π/6×a×b×c，a為血腫最大層面最大直徑(cm)，b為血腫最大層面與a垂直的直徑，c為血腫出現的層數。實驗組按血腫量分為3組，A組：出血量35～45 mL；B組：出血量45～70 mL；C組：出血量≥70 mL；

1.3標本采集臨床病例腦組織標本在手術中經皮層“造瘺"清除血腫時，將手術入路通道中鄰近血腫約0.5 cm范圍內的腦組織保存下來，作為病例組標本。將部分超早期手術組患者皮層“造瘺”起始處，即遠隔血腫部位腦組織保留下來，作為對照組標本。標本立即放入4%多聚甲醛固定溶液固定，遂行石臘包埋、切片。

石蠟切片：組織脫水、滲透與包埋：①脫水：70%乙醇(60 min)→85%乙醇(60 min)→95%乙醇(60 min)→100%乙醇(60 min)→100%乙醇(60 min)。②透明：二甲苯Ⅰ(30 min)→二甲苯Ⅱ(30 min)。③滲透：石蠟Ⅰ(60 min)→石蠟Ⅱ(60 min),62 ℃烘箱中。④包埋：將組織放入盛有石蠟的模具中，擺好位置，于石蠟包埋機的冷臺上冷卻。

切片和貼片：將包埋好的組織塊于切片機中約5 μm，放于漂片機中展開，再將切片撈于多聚賴氨酸附膜載玻片上，編號，70 ℃干烤1 h，貼片后60 ℃烤5 h。

1.4C反應蛋白免疫組化方法檢測步驟(1)熱修復：將載玻片放入容器中，加10 mM的枸櫞酸鈉緩沖液，pH 6.0；(2)標本用正常封閉血清封閉，PBS沖洗3次，每次5 min。(3)與一抗孵育60 min。(4)與熒光標記的二抗一起溫浴45 min(用于免疫組化的二抗)。(5)用液態封固劑或90%甘油PBS液封片。(6)用適當的濾鏡在熒光顯微鏡下閱片。陰性對照：每組各抽取切片2張用抗體稀釋液代替一抗，其余步驟同上。

1.5腦組織細胞凋亡檢測方法操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。

具體操作步驟：(1)用二甲苯浸洗2次，每次5 min；(2)用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；(3)PBS漂洗2次；(4)用Proteinase K工作液處理組織15～30 min在21～37 ℃(溫度、時間、濃度均需摸索)或加細胞通透液8 min；(5)PBS漂洗2次；(6)制備TUNEL反應混合液，處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μL DNase 1，反應在15～25 ℃下10 min，后面步驟同處理組。(7)玻片干后，加50 μL TUNEL反應混合液(陰性對照組僅加50 μL熒光素標記的dUTP液)于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×1 h。(8)PBS漂洗3次；(9)可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞(激發光波長為450～500 nm，檢測波長為515～565 nm)；(10)玻片干后加50 μL converter-POD于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37 ℃×30 min。(11)PBS漂洗3次；(12)在組織處加50～100 μL DAB底物，反應15～25 ℃×10 min；(13)PBS漂洗3次；(14)拍照后再用蘇木素或甲基綠復染，幾秒后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。(15)加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞(共200～500個細胞)并拍照。可結合凋亡細胞形態特征綜合判斷(未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體)。

1.6統計學處理選用統計學軟件SPSS 19.0對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗，計數資料以百分率表示，采用χ2檢驗，雙變量相關分析采用計算相關系數，查r界值表確定P值。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1細胞凋亡情況見圖1。腦出血后6 h經TUNEL檢測對照組偶見或未見凋亡細胞；而實驗組血腫周圍有凋亡細胞明顯高于對照組，出血量最大組明顯高于出血量較小組，不同出血量組TUNEL陽性細胞差異有統計學意義(F=439.573,P<0.01)。

2.2血腫周圍C反應蛋白表達情況見圖2。對照組各視野間有少量C反應蛋白陽性細胞；血腫量愈大，血腫周圍C表達愈顯著；且血腫周圍CRP表達明顯，遠離血腫腦組織表達降低，各組間差異有統計學意義(F=327.99,P<0.01)。

2.3CRP蛋白表達與凋亡的關系對CRP陽性細胞計數和凋亡陽性細胞計數進行相關性分析，結果表明二者有相關性(r=0.99,P<0.01)。見表1。

表1　不同組別TUNEL陽性細胞

注：不同出血量組陽性細胞比較，P<0.01

a　　　　　　　　　　b　　　　　　　　　　　c　　　　　　　　　　a　　　　　　　　　　b圖1 a:出血量≥70 mL組血腫周圍TUNEL陽性細胞表達情況，可見凋亡細胞數較多，左側靠近血腫側，距離血腫側愈遠陽性細胞表達愈少　b:出血量30～45 mL組TUNEL陽性細胞表達情況，可見凋亡細胞數較前組有減少，下側靠近血腫側　c:對照組TUNEL陽性細胞表達情況　圖2 a：出血量30～45 mL組血腫周圍C反應蛋白表達情況，可見少量C反應蛋白陽性細胞，右側靠近血腫側　b：出血量≥70 mL組血腫周圍C反應蛋白表達情況，可見大量C反應蛋白陽性細胞，右側靠近血腫側，可見距離血腫愈遠，陽性細胞表達愈少

3討論

高血壓腦出血發病率、致殘率、致死率、復發率高，無論國內或國外，仍缺乏特別有效的改善預后的治療方法，帶來沉重的社會經濟負擔。而探討腦出血的病理生理機制，從而尋求有效的治療方案成為目前研究的熱點。近年來，研究腦出血的病理生理機制主要包括：出血血腫壓迫周圍腦組織及繼發性缺血[11]，血腫及分解殘物毒性作用[12-13]，炎癥反應[14-15]等，而關于腦出血血腫周圍的炎癥反應研究越來越多。CRP是炎癥、感染、組織損傷、壞死和惡性腫瘤的一個重要標志。研究認為，超敏CRP>3 mg/L時，心、腦血管事件的發生危險較高，其在冠心病、腦梗死、周圍血管栓塞等疾病診斷和預測中發揮越來越重要的作用，甚至被認為是心、腦血管病危險評估的金標準。而CRP同樣可以預測腦出血患者的預后，與腦出血患者的致殘率及病死率密切相關，并以此為治療腦出血提供新的策略。以往對腦出血后血清CRP的研究較多，主要集中在血清CRP的檢測及變化過程，從而研究血清CRP表達與疾病發生發展及預后的關系。以往研究證實血清CRP主要有肝臟釋放分泌，且在炎癥介質尤其IL-6介導下表達增多，腦出血后血清CRP明顯升高主要在發病后24 h左右，在超早期6 h內甚至在正常范圍內，而以往對腦出血后血腫周圍CRP的研究極少。CRP僅是腦出血后的全身應激反應，還是直接參與腦出血的病理生理機制需進一步研究。本研究發現，腦出血血腫周圍腦組織大量表達CRP，且血腫量愈大，CRP表達愈顯著；CRP表達與凋亡細胞表達有相關性，提示CRP可能參與腦出血后血腫周圍腦細胞凋亡過程；在腦出血超早期，血腫周圍已有CRP大量表達，推測除肝臟可以釋放CRP外，神經元或膠質細胞亦能分泌CRP，這在以往研究中鮮有報道。腦出血不僅引起腦組織局部炎癥反應，也會導致全身炎癥反應應激。腦出血致損傷腦組織釋放大量炎癥介質，如IL-6。IL-6可誘導肝臟產生急性反應蛋白，主要是血清CRP的升高較為明顯。而本研究發現，腦出血血腫周圍有大量CRP表達，且遠離血腫，其表達減少。由此認為，腦出血后血清CRP表達增加，主要有肝臟產生釋放于循環系統中，血清CRP參與全身系統器官損傷過程，同時血腫周圍大量表達CRP，據此推測血腫周圍腦組織神經元或膠質細胞可能表達分泌CRP，這與Di Napoli等[16]的研究結果一致，并且血腫周圍局部CRP參與腦損傷過程，如細胞凋亡過程、水腫反應、血腦屏障破壞等繼發損傷。以往研究證實，CRP通過一些信號途徑介導內皮細胞凋亡，導致局部血流障礙，從而形成類似腦梗死半暗帶的低血流量區域[17]，且最近研究[18]也顯示CRP通過直接誘導P53介導凋亡，本研究發現血腫周圍腦組織高表達CRP區域凋亡細胞亦較豐富，提示CRP可能通過阻斷血管內皮細胞增殖導致腦組織缺血而能量匱乏或直接通過P53基因參與出血后血腫周圍細胞的凋亡過程，甚至加重血腫周圍膠質細胞炎癥反應參與腦出血的病理生理機制，由此阻斷CRP或成為治療腦出血的新策略，為下一步研究提供思路。

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(收稿2015-08-13)

【中圖分類號】R743.34

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673-5110(2016)06-0033-03