山羊支原體山羊肺炎亞種的PCR測定及動物回歸試驗

胡新崗+黃銀云+郭廣富+朱止南+田亞軍+許余良

摘要： 江蘇省泰州市肉山羊養殖業時常發生山羊支原體性肺炎，基于臨床上山羊支原體性肺炎病原的多樣性以及支原體分離培養的困難性，以疑似山羊支原體肺炎病例肺組織、胸腔滲出液、心包液為病料，采用PCR技術檢測并進行動物回歸試驗，首次證實泰州地區山羊支原體性肺炎病例中存在山羊支原體山羊肺炎亞種病原，為當地臨床防治該病提供了科學依據。

關鍵詞： 肉山羊；支原體；山羊肺炎亞種；PCR檢測；防治

中圖分類號： S858.27 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0254-02

山羊傳染性胸膜肺炎（contagious caprine pleuropneumonia，CCPP），是山羊養殖中常見的急性或慢性高度接觸性呼吸道傳染病，是世界動物衛生組織（OIE）法定報告動物傳染病之一，我國于2010年首次向OIE通報此病。臨床由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）引起，以呈現纖維素性肺炎和胸外膜炎為特征[1]。除Mccp以外，臨床上能夠引起山羊支原體性肺炎的主要病原還有絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、綿羊肺炎支原體（Movi）等，而幾種支原體在同一羊群中出現混合感染的情況也不鮮見[2]。由于臨床上支原體的分離與培養十分困難，非專業實驗室無法做到，而且這些支原體引起的山羊支原體性肺炎在臨床癥狀、大體病變僅憑肉眼難以區分，致使羊場技術人員及基層獸醫基本上只能憑經驗用藥，而無法針對病原支原體進行科學合理用藥[3]。

江蘇省泰州市肉山羊養殖業方興未艾，羊肉的需求在當地逐年攀升，但山羊支原體性肺炎嚴重影響了當地肉山羊養殖業的發展。為探明泰州市是否確實存在山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）的流行，為該病的防制提供理論依據，近年來，江蘇農牧科技職業學院課題組聯合有關基層獸醫及防檢部門專家開展了該病病原的分子生物學（PCR）檢測并通過動物回歸試驗，首次證實在泰州地區確實存在由山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）引起的山羊傳染性胸膜肺炎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無菌操作，采集江蘇省泰州市（精確到區）某山羊養殖場發生呼吸道疾病，經初步診斷為山羊傳染性胸膜肺炎，使用抗生素治療效果不佳，臨床癥狀明顯，肺臟呈現典型纖維素性肺炎的病山羊肺臟、胸腔滲出液及心包液，-20 ℃冷凍作為病料備用。

1.1.1 儀器設備 Mikro200R冷凍高速離心機、JS-380A自動凝膠圖像分析儀、PCR儀（PTC-200rev）、DYY-7C型電泳儀、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳槽、恒溫箱、微量移液器等。

1.1.2 試劑 基因組DNA快速抽提試劑盒（動物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2、10×PCR buffer、100 bp DNA Ladder和6× DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）均購自上海生工生物工程有限公司，其他試劑均為國產分析純。山羊支原體山羊肺炎亞種Mccp正向間接血凝診斷試劑盒、絲狀支原體山羊亞種Mmc正向間接血凝診斷試劑盒、綿羊肺炎支原體Mo正向間接血凝診斷試劑盒購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所。

1.2 方法

1.2.1 病料采集和處理 在肺組織病變與健康組織交界處無菌取樣，將0.5～1 g肺組織研磨研碎，按1 ∶ 4加入無菌含雙抗的pH值為7.2的PBS溶液，混勻后分裝到EP管；胸腔滲出液和心包積液取上清，分裝到EP管。處理好的病料于冰箱-20 ℃保存備用。

1.2.2 引物的設計與合成 根據文獻[4]的方法，合成1對Mccp引物，片段針對Mccp Adi基因中的一段序列，長316 bp。引物序列為：上游引物：5′-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG-3′；下游引物：5′-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 組織病料DNA的提取 用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。具體步驟如下：

①3 000 r/min離心10 min，取上清200 μL轉移至新EP管中；②加入400 μL buffer Digestion，振蕩混勻，65 ℃水浴60 min；③加入200 μL buffer PA，充分顛倒混勻，-20 ℃下保存5 min；④室溫10 000 r/min離心5 min，取上清500 μL轉移至新EP管中；⑤加500 μL異丙醇，顛倒5～8次混勻，室溫放置 2 min，室溫10 000 r/min離心5 min，棄上清；⑥加1 000 μL 75%乙醇，顛倒漂洗2 min，10 000 r/min離心2 min，棄上清；⑦重復⑥步驟1次；⑧開蓋室溫倒置5～10 min；⑨加入100～200 μL TE buffer溶解。⑩-20 ℃ 保存或立即進行下一步試驗。

1.2.4 PCR檢測Mccp 以提取的組織病料DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用50 μL反應體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、上下游引物各1 μL、3 μL cDNA、Taq DNA聚合酶1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，47 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結果。

1.2.5 動物回歸試驗 選擇6只臨床健康體質量為5 kg的波爾雜交肉山羊，購進后投服驅蟲藥物，預飼7 d，預飼期間每天分別于上午、下午測溫1次，采血后采用購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制的山羊支原體山羊肺炎亞種Mccp正向間接血凝診斷試劑盒、絲狀支原體山羊亞種MMC正向間接血凝診斷試劑盒、綿羊肺炎支原體MO正向間接血凝診斷試劑盒檢測，確定無支原體感染。采用自然病例胸腔滲出液、心包液原液，經PCR檢測、確認存在Mccp后，以10倍生理鹽水稀釋液，通過氣管注射和滴鼻2種途徑接種其中4只，留取2只僅注射等量生理鹽水作為對照。常規飼養管理，重視環境消毒，逐日觀察并記錄癥狀，撲殺后記錄病變。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

對病料進行PCR檢測，得到MCCP目的基因片段，片段大小為316 bp（圖1），與預期的結果相符。

2.2 動物回歸試驗結果

4只試驗羊分別在接種后15、17、22、26 d表現癥狀，最初病羊喜臥，間歇性咳嗽，體溫略有升高，食欲有所下降，但仍會進食并反芻。隨病程發展，病羊不愿走動，或蜷臥低頭閉目，或四肢外展站立，脖頸伸直，呼吸急促，劇烈咳嗽，閉眼，眼瞼周圍有漿液性分泌物，口鼻流涎，鼻孔逐漸被膿性分泌物堵塞，反芻停止、腹瀉及肛周污穢。病程后期，病羊倒地側臥不起，急促腹式呼吸，舌頭伸出，痛苦呻吟，不久即死亡3只。剖檢可見病羊病變僅限于胸腔，呈典型胸膜肺炎病變，主要表現為單側性局部肝樣變，胸腔有大量滲出液，嚴重的肺和胸膜粘連，需用手才能剝離肺臟。對比可知，試驗羊的臨床癥狀和病理變化與本試驗中自然發病羊一致。利用采自試驗羊的病料，再行PCR鑒定，仍然可以得到本研究中的PCR擴增結果，進一步證實，本研究中山羊傳染性胸膜肺炎的病原為山羊支原體山羊肺炎亞種（Mccp）。

3 分析與討論

由于支原體較難分離與培養，臨床上僅靠癥狀及病理剖檢很難確診山羊支原體性疫病[3]。在山羊傳染性胸膜肺炎病原分離對試驗條件的高要求及生產中實際分離率非常低的情況下，臨床上采用PCR技術直接通過病料快速檢測Mccp是當前診斷CCPP流行病學研究的有效手段，避免因為漫長而艱難的Mccp分離純化而花費大量的時間、精力和財力，提高臨床該病的防治效率和效果[5]。

國內不同地區山羊傳染性胸膜肺炎病原的差異性很大，研制安全高效廣譜的支原體疫苗是控制山羊支原體性肺炎的重要途徑。目前我國使用的山羊傳染性胸膜肺炎滅活疫苗是用絲狀支原體山羊亞種（Mmc）制備的，從理論上來說，該疫苗不可能完全保護山羊免受Mccp 的侵襲[6]。因此地方政府應聯合生物制品生產單位盡快分離地方性流行菌株制備針對地方的可靠疫苗。規模化羊場也可在發病后聯合有條件的科研院所制備針對本場的自家苗用于緊急預防。

泰州地區肉羊場山羊傳染性胸膜肺炎的發病大多與引入未經檢疫的隱性感染羊有關。建議肉羊場大規模引入肉羊前，可先請有條件的單位對擬引入肉羊開展山羊支原體肺炎檢測，確認無感染再行引入。引入后應加強飼養管理，嚴格實施防疫檢疫等措施。規模化羊場最好實行自繁自養、全進全出飼養制度，減少因引入新羊帶來病原體。一旦發病，不要自行治療延誤時機，應盡快求助獸醫部門或權威科研機構幫助確診，科學合理防控疫情。由于耐過病羊在相當長時間內可通過呼吸道向外界排毒而成為傳染源，因此發現病羊務必隔離治療[7]。

參考文獻：

[1]辛九慶，李 媛，張建華，等. 一株山羊支原體山羊肺炎亞種的分離鑒定與分子特征[J]. 中國預防獸醫學報，2007，29（4）：243-248.

[2]王 華，楊發龍，王 永，等. 山羊支原體性肺炎流行病學調查[J]. 中國畜牧獸醫，2011，38（1）：210-214.

[3]儲岳峰，逯忠新，趙 萍，等. 絲狀支原體山羊亞種抗體間接血凝檢測方法的建立及應用[J]. 畜牧與獸醫，2007，39（10）：64-66.

[4]儲岳峰. 我國山羊（接觸）傳染性胸膜肺炎病原學、流行病學研究及滅活疫苗的研制[D]. 北京：中國農業科學院，2011.

[5]儲岳峰，趙 萍，高鵬程，等. 從山羊中檢測山羊支原體山羊肺炎亞種[J]. 江蘇農業學報，2009，25（6）：1442-1444.

[6]趙 萍，儲岳峰，高鵬程，等. 羊霉形體病的疫苗預防及藥物治療[J]. 甘肅畜牧獸醫，2008，38（4）：44-46.

[7]張建華，辛九慶，李 媛. 山羊傳染性胸膜肺炎的診斷與防治[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2007（3）：68-70.