Wnt信號通路抑制劑對腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用及其作用機制研究

張驚宇,張力娜,鄭永慧,孫永奇，劉路然,趙 虹，楊子超

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科

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·論著·

Wnt信號通路抑制劑對腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用及其作用機制研究

張驚宇,張力娜,鄭永慧,孫永奇，劉路然,趙 虹，楊子超

150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科

【摘要】目的探究Wnt信號通路抑制劑(IWR-1)對腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用及其作用機制。方法2014年1月—2015年8月，體外培養腦膠質瘤細胞，給予不同濃度IWR-1處理，采用MTT法測定腦膠質瘤細胞增殖情況，并計算其抑制率，其中實驗1組終濃度為5 μmol/L IWR-1、培養液、細胞懸液，實驗2組終濃度為10 μmol/L IWR-1、培養液、細胞懸液，對照組添加等量培養液和細胞懸液。采用蛋白質印跡法檢測Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平。結果實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于實驗1組(P<0.05)；培養48 h時實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率均高于培養24 h(P<0.05)；培養48 h與24 h對照組腦膠質瘤細胞增殖抑制率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于實驗1組(P<0.05)。結論IWR-1能有效抑制腦膠質瘤細胞增殖，其作用機制可能與抑制Wnt5a蛋白和β-連鎖蛋白的表達有關。

【關鍵詞】神經膠質瘤；腦腫瘤；細胞增殖；Wnt信號通路抑制劑

張驚宇,張力娜,鄭永慧,等.Wnt信號通路抑制劑對腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用及其作用機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2016，24(3)：49-52.[www.syxnf.net]

Zhang JY，Zhang LN，Zheng YH，et al.Inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors on brain glioma cell proliferation and the action mechanism[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2016，24(3)：49-52.

腦膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，位居所有癌癥死亡原因的前十位，患者平均生存時間為14.6個月，5年生存率<5%[1-2]。目前，臨床上治療腦膠質瘤主要以手術為主，術后進行輔助放化療，但患者術后平均生存期僅為3～5年，其總體治療效果仍不理想。因此，尋找治療腦膠質瘤的新途徑或新靶點已成為臨床主要研究方向[3-4]。相關臨床研究表明，Wnt信號通路與中樞神經系統關系密切，其可調節神經干細胞的增殖、遷移和分化[5]。Wnt信號通路在胚胎發育完成后幾乎不再發揮相關功能，但在一定病理生理刺激下可被激活[6]，促使Wnt信號通路活化。有學者認為，抑制Wnt信號通路或可成為腦膠質瘤等基因治療的新方向[7]。本研究通過體外培養膠質瘤細胞，并給予不同濃度的Wnt信號通路抑制劑(IWR-1)進行處理，采用MTT法測定細胞增殖情況，探究IWR-1對腦膠質瘤細胞增殖的抑制作用，并分析其作用機制，現報道如下。

1材料與方法

1.1主要試劑與細胞高糖DMEM培養基(HyClone公司)，胎牛血清(杭州四季青集團公司)，β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，BCA試劑盒(碧云天生物技術研究所)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，Millipore公司)；腦膠質瘤細胞株購自上海銳賽生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養2014年1月—2015年8月，用移液槍吸取200 μl腦膠質瘤細胞懸液于96孔細胞培養板中，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養培養24 h，倒置顯微鏡下觀察組織塊是否貼壁，取對數生長期、細胞活性>95%的細胞進行后續實驗。

1.2.2MTT法取處于對數生長期的腦膠質瘤細胞接種于96孔細胞培養板中，鋪板并將待測細胞密度調至3 000個細胞/孔，190 μl培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞培養24 h后，分別添加5 μmol/L IWR-1、10 μmol/L IWR-1，記為實驗1組、實驗2組。將細胞培養板置于培養箱中繼續培養24 h、48 h。培養完畢后，吸棄培養液，每孔加入4 ℃預冷的10%三氯乙酸100 μl，靜置5 min后移入4 ℃冰箱中固定1 h，取出并用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。每孔加入0.4%磺酰羅丹明B(SRB)染液100 μl，室溫下染色15 min后，棄去各孔內染液，用1%乙酸沖洗5次，室溫晾干后，用非緩沖Tris-base堿液溶解，在平板振蕩器上振蕩20 min，酶標儀測540 nm波長處吸光度(OD)，并按公式計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率(%)=〔1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)〕×100%。每組重復檢測4次取平均值。實驗中設置空白組(僅添加等量的培養液)和對照組(添加等量培養液和細胞懸液)。

1.2.3蛋白質印跡法加入RIPA裂解液150 μl及苯甲基磺酰氟(PMSF)1.5 μl冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。每個樣本各取15 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉PDVF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別添加Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后加入1∶5 000二抗(北京中杉金橋生物科技公司)，用增敏化學發光底物試劑(ECL)處理后在凝膠成像系統顯像，采用Image J軟件進行蛋白定量分析。每組重復檢測3次取平均值。

2結果

2.13組腦膠質瘤細胞增殖抑制率比較3組培養24h、48h時腦膠質瘤細胞增殖抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于實驗1組，差異有統計學意義(P<0.05)；培養48h時實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率均高于培養24h，差異有統計學意義(P<0.05)；培養48h與24h對照組腦膠質瘤細胞增殖抑制率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

Table1Comparisonofinhibitionratioofbraingliomacellsproliferationamongthethreegroups

組別培養24h培養48h對照組1.52±0.101.55±0.27實驗1組41.57±1.38b60.49±1.35ab實驗2組63.15±1.84bc86.73±2.67abcF值753.46544.36P值<0.001<0.001

注：與培養24 h時比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05；與實驗1組比較，cP<0.05

2.23組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平比較3組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于實驗1組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表23組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平比較

Table2ComparisonofexpressionsofWnt5aproteinandβ-cateninofbraingliomacellsamongthethreegroups

組別Wnt5a蛋白β-連鎖蛋白對照組36.84±10.6251.02±12.46實驗1組21.06±9.25a34.57±12.01a實驗2組13.28±9.04ab20.14±10.58abF值234.57413.58P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與實驗1組比較，bP<0.05

3討論

腦膠質瘤為最常見的顱內腫瘤，具有典型的“三高一低”(高發病率、高復發率、高病死率、低治愈率)特征[8]。腦膠質瘤占腦腫瘤的50%左右，其發生發展與遺傳因素和環境因素共同作用有關，由于其呈浸潤性生長且邊界不明顯，因此手術并不能完全根除病灶，臨床治愈率極低[9-10]。目前臨床主要采用手術并輔以術后放化療治療腦膠質瘤，但治療效果并不理想[11]。隨著分子生物學技術的發展，生物靶向治療逐漸成為腦膠質瘤的主要治療方向，尋找腫瘤診斷和預后的特異性分子標志物以及藥物治療的靶目標已成為時下研究的熱點[12]。

在腦膠質瘤眾多相關潛在分子標志物中β-連鎖蛋白備受矚目，β-連鎖蛋白不僅參與細胞的增殖及分化、組織器官生長發育、損傷后組織修復等病理生理過程，且在諸多腫瘤組織中均呈高表達[13]。國內外最新研究結果顯示，β-連鎖蛋白的表達水平與腫瘤侵襲、轉移以及預后緊密相關，很可能是在腫瘤發生、發展和轉移等多個環節中發揮作用的重要癌基因[14-15]。對Wnt信號通路的最早認識來自于果蠅發育機制和致癌病毒的研究。Wnt/β-連鎖蛋白是經典的Wnt信號通路，也是目前研究較詳細的一條Wnt信號轉導通路；其中，β-連鎖蛋白是Wnt信號通路中將信號向細胞核傳遞過程中的重要信號分子。β-連鎖蛋白作為Wnt信號通路的關鍵蛋白，其去磷酸化可降低Wnt信號通路向核內轉移，是目前引起人們廣泛關注的靶向治療方案[16]。有學者認為，抑制Wnt信號通路是腦膠質瘤基因治療的新策略之一[17]。Wnt5a蛋白屬于Wnt蛋白家族成員之一，Wnt家族蛋白不僅在細胞的增殖、分化中發揮調節作用，亦在多種腫瘤中表達異常，或增高或降低或缺失。Wnt5a蛋白同樣也參與了腫瘤的發生發展，包括腫瘤細胞血管生成、遷移、侵襲等惡性生物學過程[18]。

IWR-1是新合成的Wnt信號通路小分子抑制劑,可以通過穩定Axin降解復合物而抑制Wnt信號通路[19]。本研究結果顯示，實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率高于實驗1組；培養48 h時實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞增殖抑制率均高于培養24 h；培養48 h與24 h對照組腦膠質瘤細胞增殖抑制率間無差異；表明不同濃度的IWR-1對腦膠質瘤細胞的增殖均具有明顯抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯。蛋白質印跡實驗結果顯示，實驗1組、實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于對照組，實驗2組腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達水平低于實驗1組；表明IWR-1可抑制腦膠質瘤細胞中Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白表達，而Wnt5a蛋白、β-連鎖蛋白即Wnt5a/β-連鎖蛋白信號途徑，因此推測Wnt5a/β-連鎖蛋白信號通路或可成為治療腦膠質瘤的新靶點。

綜上所述，IWR-1能有效抑制腦膠質瘤細胞增殖，其作用機制可能與抑制Wnt5a蛋白和β-連鎖蛋白的表達有關。

作者貢獻：張驚宇、趙虹進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；張力娜、鄭永慧、孫永奇、劉路然進行實驗實施、評估、資料收集；楊子超進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]劉秀芳,夏云飛,韓非，等.164例膠質瘤術后放射治療療效及預后[J].中華放射腫瘤學雜志,2001,10(2):108-111.

[2]陳忠平.膠質瘤治療的困惑與思考[J].中華神經外科雜志,2008,24(4):310-311.

[3]高謀,徐如祥,楊志軍，等.干細胞在膠質瘤治療中的研究進展[J].中華神經醫學雜志,2014,13(5):531-533.

[4]張力偉.關注腦干膠質瘤治療的動向[J].中華神經外科雜志,2015,31(2):109-111.

[5]Valvezan AJ,Klein PS.GSK-3 and Wnt Signaling in Neurogenesis and Bipolar Disorder[J].Front Mol Neurosci,2012.doi:10.3389/fnmol.2012.00001.eCollection 2012.

[6]唐志英.Wnt信號通道的分子學機制及在牙胚發育中的調控作用[J].國外醫學：口腔醫學分冊,2002,29(5):265-267.

[7]何東杰,胡靜,魏麗春，等.Wnt信號調控膠質瘤或膠質瘤干細胞增殖及遷移作用的研究進展[J].現代腫瘤醫學,2013,21(10):2354-2358.

[8]仇德利.膠質瘤治療的現狀與展望[J].醫學理論與實踐,2007,20(3):275-277.

[9]陳延明,董軍,黃強，等.膠質瘤血管起源細胞的研究現狀:血管新生和血管發生兩種觀點的碰撞[J].中華神經醫學雜志,2014,13(1):93-95.

[10]劉艷輝.復發膠質瘤治療探討//中華中青年神經外科交流協會第二屆學術大會論文集[C].2013:172.

[11]李鵬,李文良,孫增峰，等.氬氦刀冷凍消融治療腦膠質瘤的現狀與展望[J].中國腫瘤臨床,2014,41(5):345-348.

[12]費帆.腦膠質瘤分子靶向與優化治療[J].實用醫院臨床雜志,2011,8(2):199-201.

[13]李斐,江普查,袁先厚，等.N-cadherin、E-cadherin及β-catenin在膠質瘤中的表達及意義[J].中國臨床神經外科雜志,2007,12(9):536-539.

[14]武文浩,泮長存,田永吉，等.Wnt/β-catenin信號轉導途徑相關分子在腦干膠質瘤中的表達及其意義[J].中華神經外科雜志,2015,31(2):124-128.

[15]Lin YC,Wu MY,Li DR,et al.Prognostic and clinicopathological features of E-cadherin,alpha-catenin,beta-catenin,gamma-catenin and cyclin D1 expression in human esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol，2004，10(22):3235-3239.

[16]張志強,陳紅慶,陳映紅，等.腦膠質瘤中β-catenin和細胞周期素D1表達的意義[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(11):1010-1012.

[17]郝少才,王峰,牛占鋒，等.Wnt/β-catenin通路相關蛋白在復發膠質瘤中的表達及其臨床意義[J].寧夏醫科大學學報,2014,36(8):838-841.

[18]丁厚中.Wnt5a蛋白在人乳腺癌中的表達及其意義[D].鎮江：江蘇大學，2015.

[19]徐慶生,章瑋.人腦膠質瘤中 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin的表達及相關性分析[J].醫藥前沿,2012,2(29):172.

(本文編輯：毛亞敏)

Inhibiting Effect of Wnt Signaling Pathway Inhibitors on Brain Glioma Cell Proliferation and the Action Mechanism

ZHANGJing-yu，ZHANGLi-na，ZHENGYong-hui，etal.DepartmentofNeurology，theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity，Harbin150081，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the inhibiting effect of Wnt signaling pathway inhibitors(IWR-1)on brain glioma cell proliferation and the action mechanism.MethodsFrom January 2014 to August 2015，their brain glioma tissues were collected to culture in vitro.MTT method was used to detect the cell proliferation，and the inhibition ratio was calculated；thereinto the final concentration of A group was 5 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，of B group was 10 μmol/L(including IWR-1，culture solution and cell suspension)，while C group included equivalent culture solution and cell suspension only.Western blot method was used to detect the expressions of Wnt5a protein and β-catenin.ResultsThe inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that of C group，respectively，and the inhibition ratio of B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).After 48 hours of culture，the inhibition ratio of A group，of B group was statistically significantly higher than that after 24 hours of culture，respectively(P<0.05)，while no statistically significant differences of inhibition ratio of C group was found compared to that after 24 hours(P>0.05).The expressions of Wnt5a protein and β-catenin of A group and B group were statistically significantly lower than those of C group，expressions of Wnt5a protein and β-catenin of B group were statistically significantly lower than those of A group(P<0.05).ConclusionIWR-1 can effectively inhibit the brain glioma cell proliferation，its action mechanism is possibly correlated with the inhibition of expressions of Wnt5a protein and β-catenin.

【Key words】Glioma；Brain neoplasms；Cell proliferation；Wnt signaling pathway inhibitors

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-03-06)

【中圖分類號】R 739.41

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1008-5971.2016.03.013

通信作者：趙虹，150081黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫科大學附屬第四醫院神經內科；E-mail：zhaohong661214@163.com

基金項目：黑龍江省教育廳科學技術研究項目(12531257)