白花丹參水提物對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制探討

黃東輝，李廣紅，韓靜靜，侯麗君(泰山醫學院臨床學院，山東泰安7000；泰山醫學院附屬醫院)

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白花丹參水提物對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響及其機制探討

黃東輝1，李廣紅2，韓靜靜1，侯麗君2(1泰山醫學院臨床學院，山東泰安271000；2泰山醫學院附屬醫院)

摘要：目的 探討白花丹參水提物對糖尿病(DM)大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法選擇48只大鼠予高糖高脂飼養，經尾靜脈注射鏈脲佐菌素35 mg/kg制備DM模型，隨機分為DM組、LD組、HD組、WD組，每組各12只。另選擇12只正常大鼠作為正常對照組(NC組)。造模成功后，LD組、HD組分別以白花丹參提取物15、30 g/(kg·d)灌胃，WD組以厄貝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃，DM組以等劑量的生理鹽水灌胃，均持續4周。NC組不灌胃。各組于造模后第4周末，末次給藥后處死，取心肌組織，采用Western blot法檢測凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X(Bax)蛋白、Bcl-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bnip-3)的表達。結果DM組細胞凋亡明顯，WD組、LD組細胞凋亡較DM組減輕，HD組心肌病理表現明顯好于WD組和HD組。DM組Bcl-2蛋白表達低于其他各組，WD組、LD組Bcl-2蛋白表達均低于HD組(P均<0.01)。DM組Bax、Bnip-3蛋白表達均高于其他各組，WD組、LD組Bax、Bnip-3蛋白表達均高于HD組(P均<0.01)。結論白花丹參可減輕DM大鼠心肌細胞的凋亡，其機制可能與增加心肌組織Bcl-2蛋白表達、降低Bax及Bnip-3蛋白表達有關。

關鍵詞：白花丹參；糖尿病心肌??；心肌細胞；細胞凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病(DM)的嚴重并發癥，是DM患者的主要死亡原因之一[1]。目前，DCM的發病機制尚未完全明確，心肌細胞凋亡在DCM的發生發展中具有重要作用。厄貝沙坦是血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑，可通過阻斷血管緊張素作用從而抑制DCM的發展[2]。白花丹參為泰山特有珍稀藥用植物，具有良好的降糖、調脂、改善血流動力學作用。研究發現，白花丹參可抑制DCM的發生和發展，具有抗氧化、抗炎、抑制晚期糖基化終未產物(AGEs)形成的作用。B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白是抗凋亡蛋白，Bcl-2相關X(Bax)蛋白、Bcl-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bnip-3)是促凋亡蛋白，均參與心肌細胞的凋亡過程。2014年9月～2015年1月，我們觀察了白花丹參對DM大鼠心肌細胞凋亡的影響并探討其機制，為其臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1動物及試劑健康雄性Wistar大鼠60只，由山東魯抗公司實驗動物中心提供，質量合格證號20141012號，體質量200～220 g。鏈脲佐菌素(STZ)購自北京博愛科貿有限公司；兔抗鼠Bcl-2、Bnip-3、Bax多克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；厄貝沙坦購自浙江華海藥業股份有限公司。

1.2白花丹參提取物制備將白花丹參塊根切片后，加適量蒸餾水浸泡2 h，加熱煮沸。先用強火，煮沸后改用文火，繼續微沸30 min。過濾后，剩余藥渣再加適量蒸餾水煮沸30 min，過濾后合并上述濾液，經旋轉蒸發儀濃縮、蒸餾水稀釋至所需濃度灌封，4 ℃保存備用。

1.3DM模型制備選擇48只大鼠予高糖高脂飼料飼養1個月，按STZ 35 mg/kg經尾靜脈一次性注射制備DM模型。72 h后尾尖取血，檢測毛細血管血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為DM模型造模成功[3,4]。

1.4分組及干預方法將48只DM模型大鼠隨機分為糖尿病組(DM組)、白花丹參小劑量組(LD組)、白花丹參大劑量組(HD組)、厄貝沙坦組(WD組)，每組各12只。其余未造模的12只正常大鼠作為正常對照組(NC組)，正常飼養。造模成功后，LD組、HD組分別以白花丹參提取物15、30 g/(kg·d)灌胃，WD組予以厄貝沙坦17.5 mg/(kg·d)灌胃，DM組以等劑量的生理鹽水灌胃,共干預4周。NC組不干預。

1.5血糖水平檢測于灌胃的第4周末，末次給藥后，禁食12 h，斷尾取尾靜脈血測定空腹血糖(FPG)。

1.6心肌組織病理觀察采用HE染色法。取心肌組織，心肌切片常規二甲苯脫蠟、梯度乙醇浸泡至水，PBS沖洗，切片上加入TdT和DIG-dUTP混合液置于濕盒中37 ℃標記2 h，加封閉液、生物素化抗地高辛抗體，DAB顯色。以不加TdT作為陰性對照。400倍高倍鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，凋亡細胞表現為核固縮、染色質濃染呈深淺不一的棕褐色，正常細胞核呈藍色。

1.7凋亡相關蛋白表達檢測采用Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Bnip-3表達。取部分心肌制成10%組織勻漿，離心后取上清液，采用Lowry法測定心肌蛋白質含量。用10%的SDS-PAGE分離樣品蛋白質，調整泳道蛋白上樣量為30 mg，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，轉硝酸纖維素膜，封閉后沖洗；將膜放入一抗中4 ℃過夜，然后將膜加入堿性磷酸酶標記的二抗中室溫孵育1 h，顯色后拍照，蛋白表達量以其與內參蛋白條帶的灰度比值表示。

2結果

2.1各組FPG水平及心肌組織中凋亡相關蛋白表達比較NC組FPG正常，DM組、WD組、LD組、HD組FPG均高于NC組，LD組、HD組FPG均低于WD組、DM組，HD組FPG低于LD組(P均<0.01)。DM組Bcl-2蛋白表達低于其他各組，WD組、LD組Bcl-2蛋白表達均低于HD組(P均<0.01)。DM組Bax、Bnip-3蛋白表達均高于其他各組，WD組、LD組Bax、Bnip-3蛋白表達均高于HD組(P均<0.01)。見表1、圖1。

表1　　　　各組大鼠FPG、心肌組織Bcl-2、Bax、

注 ：與DM組比較，*P<0.01；與HD組比較，#P<0.01。

2.2心肌組織病理觀察NC組心肌細胞核呈藍色，細胞核無固縮，細胞間界限清，心肌纖維走行正常。DM組心肌棕褐色多，細胞核壞死明顯，凋亡細胞數量多，心肌纖維走行紊亂。WD組凋亡現象較DM組減輕，但也存在心肌纖維走行紊亂。LD組凋亡現象較DM組、WD組均減輕，棕褐色減少，心肌纖維走行有序。HD組凋亡細胞數最少，心肌纖維走行有序，心肌病理表現明顯好于WD組和HD組。

注：1為NC組；2為DM組；3為WD組；4為LD組；5為HD組。

圖1各組Bcl-2、Bax、Bnip-3蛋白表達

情況(Western blot法)

3討論

DCM病變特點是在舒張功能早期即出現心肌損害，伴有心肌肥厚的發展，出現心肌細胞壞死、心肌纖維化[5]和心肌細胞凋亡[6]等。DCM的原因可能與氧化應激、炎癥反應或其他導致心肌損傷的因素有關，最終均可出現心肌細胞凋亡，進而引起心肌功能失常，出現心力衰竭。細胞凋亡是細胞的程序性死亡過程，在心血管疾病、DCM和心肌細胞損傷中發揮重要作用。研究表明，抑制心肌細胞凋亡對心功能具有保護作用，可防止、延緩心衰的發生與發展[7]。

Bcl-2家族是心肌細胞凋亡過程中非常重要的調節因子[8]，根據功能主要分為兩類，包括抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bnip-3、Bax等，均參與了心肌細胞的凋亡過程。研究發現，DM大鼠心肌細胞中Bcl-2蛋白表達降低，與心肌細胞的凋亡密切相關[9～11]。研究表明，Bcl-2表達的減少可能與腺苷酸活化激酶(AMPK)的活性降低有關，從而促進細胞凋亡[12]。Bcl-2有抗氧化應激、阻斷Ca2+從內質網釋出的作用，并能決定線粒體滲透性轉換孔開關的狀態，從而調控凋亡過程。Bax基因可以促進細胞凋亡，這種作用與線粒體的活性氧(ROS)系統激活有關[13]。研究發現，通過增加DM大鼠心肌組織Bcl-2/Bax值，可抑制心肌細胞凋亡，延緩DCM的發生發展[14]。Bnip-3是近年來受到關注的促凋亡因子，在細胞內與線粒體相互作用后可引起心肌細胞氧化。在高血糖時，這種作用可上調線粒體呼吸和氧化應激相關基因的表達，并直接影響細胞線粒體跨膜電勢差、促進心肌脂肪酸氧化代謝，發揮促凋亡功能。研究發現，Bnip-3參與了DM心肌細胞內炎癥因子表達上調和調控鈣穩態，在DCM的病變過程中具有一定作用。因此，Bcl-2、Bnip-3、Bax作為調控細胞凋亡的重要因素，可作為DCM重要標志性蛋白，為治療DCM提供了有效靶點。本研究發現，DM組心肌細胞凋亡數量多,Bcl-2蛋白表達降低，Bax、Bnip-3蛋白表達增高，提示DM大鼠出現明顯的心肌細胞凋亡，并出現凋亡相關蛋白Bcl-2、Bnip-3、Bax蛋白的表達異常。

白花丹參具有丹參的藥理作用，其丹參酮ⅡA的含量是普通丹參的2倍，隱丹參酮、丹酚酸以及微量元素的含量比普通丹參高數倍。研究表明，白花丹參的水溶性成分具有很強的抗脂質過氧化、自由基清除作用，并對血脂和血糖有調節作用[15]。目前，白花丹參已廣泛用于防治冠心病、腦血管病和外周血管的多種病變，但對其在DM慢性并發癥及DCM治療中的作用尚無研究。本研究發現，LD組、HD組FPG均低于WD組、DM組，HD組FPG低于LD組，提示白花丹參對DM大鼠血糖有良好的控制作用，且高劑量應用時降糖效果更好；WD組、LD組、HD組凋亡現象較DM組減輕，且HD組心肌病理表現明顯好于WD組和LD組，提示白花丹參可明顯減輕DCM細胞凋亡，且優于WD組；DM組Bcl-2蛋白表達低于其他各組，Bax、Bnip-3蛋白表達均高于其他各組，HD組Bcl-2蛋白表達均高于WD組、LD組，而Bax、Bnip-3蛋白表達均低于WD組、LD組，提示白花丹參可有效提高心肌Bcl-2蛋白含量，降低心肌Bax、Bnip-3蛋白含量，抑制心肌細胞凋亡。

綜上所述，白花丹參可抑制DM大鼠心肌細胞的凋亡，其機制可能與提高心肌組織Bcl-2蛋白、降低心肌Bax、Bnip-3蛋白表達有關，從而延緩DCM的發病進程。

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Effects of Salvia miltiorrhiza water-extract on apoptosis of myocardial cells in rats with diabetes mellitus

HUANGDonghui1,LIGuanghong,HANJingjing,HOULijun

(1TaishanMedicalCollege,Taian271000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Salvia miltiorrhiza water-extract on apoptosis of myocardial cells in rats with diabetes mellitus (DM).MethodsForty-eight male Wistar rats were fed with high-glucose and high-fat diet and then were injected with streptozotocin (35 mg/kg) to establish diabetes mellitus (DM) models. After that, all model rats were randomly divided into the DM group (DM group), Western medicine group (WD group), low-dose (LD) and high-dose (HD) Chinese medicine groups, 12 rats in each group. Meanwhile, another 12 healthy rats were selected as the normal control group (NC group).After modeling, LD and HD groups were given 15 g/(kg·d) and 30 g/(kg·d) Salvia miltiorrhiza water-extract through intragastric administration, WD group was given 17.5 mg/(kg·d) irbesartan, and DM group was treated with the same dose of normal saline for 4 weeks. On week 4 after modeling, the expression of apoptosis-related protein (Bcl-2), Bcl-2-related protein (Bax) and Bnip-3 was detected by Western blotting.ResultsThe apoptosis of myocardial cells in the DM group was more significant, the apoptosis of the WD and LD groups alleviated as compared with that of the DM group, and the pathological manifestations of the HD group was better than that of the WD and LD group. The Bcl-2 protein expression of the DM group was lower that of the other groups, and the Bcl-2 protein expression of the WD and LD groups was lower than that of the HD group (all P<0.01). Bnip-3 and Bax protein expression of the DM group was higher than that of the other groups, and Bnip-3 and Bax protein expression of the WD and LD groups was higher than that of the HD group (all P<0.01). ConclusionSalvia miltiorrhiza water-extract can alleviate the apoptosis of myocardial cells in DM rats, and the mechanism may be related to the increased Bcl-2 protein expression and the decreased Bnip-3 and Bax protein expression.

Key words:Salvia miltiorrhiza water-extract; diabetic cardiomyopathy; myocardial cells; apoptosis

(收稿日期：2015-11-04)

中圖分類號：R541.9；R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)14-0007-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.003

第一作者簡介：黃東輝(1978-)，男，碩士學位，副教授，主要研究方向為內分泌與代謝疾病。E-mail: ahuang1115 @126.com

基金項目：山東省中醫藥科技發展計劃項目(2011-226);山東省高等學?？萍加媱濏椖?J12LL03)。