芒柄花黃素對人鼻咽癌細胞株HONE1凋亡的誘導作用及其機制探討

祁承林，梁娟，李恒，楊學敏，唐安洲(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

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芒柄花黃素對人鼻咽癌細胞株HONE1凋亡的誘導作用及其機制探討

祁承林，梁娟，李恒，楊學敏，唐安洲(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

摘要：目的觀察芒柄花黃素對人鼻咽癌細胞株HONE1細胞凋亡的誘導作用，并探討其相關機制。方法用含不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)芒柄花黃素的培養基分別培養人鼻咽癌細胞株HONE1 24、48、72 h，采用MTT法觀察芒柄花黃素對HONE1細胞活性的影響。采用Hoechst33258熒光染色從形態學上觀察芒柄花黃素處理的HONE1細胞凋亡情況。用Western blotting檢測不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)芒柄花黃素處理的HONE1細胞的p-Akt、Akt、BAX和Bcl-2蛋白。結果Hoechst33258熒光染色結果顯示，芒柄花黃素處理較未處理的人鼻咽癌細胞株HONE1凋亡細胞數明顯增加。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細胞p-Akt/Akt值分別為0.311±0.035、0.169±0.029、0.116±0.038、0.143±0.012、0.082±0.015，5、10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細胞BAX/Bcl-2值分別為1.445±0.167、1.678±0.257、2.637±0.619、3.292±0.339、4.285±0.899，10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。結論芒柄花黃素可誘導人鼻咽癌細胞株HONE1細胞凋亡，這可能是通過下調p-Akt/Akt、上調BAX/Bcl-2實現的。

關鍵詞：芒柄花黃素；鼻咽癌；細胞凋亡；B淋巴細胞瘤2

當前，對于鼻咽癌[1]的治療是以放療為主結合化療的綜合治療。但傳統放化療會引起患者局部及全身一系列不良反應。因此尋找一種具有低毒、高效的新型化療替代藥是當前抗鼻咽癌研究的熱點。從中草藥提取出的成分如馬鈴薯提取物、苦參堿等因具有抗腫瘤活性[2,3]而越來越引起研究者重視。中草藥作為抗鼻咽癌輔助治療比單純應用放療或者化療能更顯著提高患者生存質量，減輕不良反應，改善免疫功能[4]。芒柄花黃素是黃芪的主要活性成分，對乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌等具有一定的抗腫瘤活性[5～7]，但對于鼻咽癌的作用卻鮮有報道。且鼻咽癌多為未分化癌。本研究觀察了芒柄花黃素對低分化人鼻咽癌細胞株HONE1細胞凋亡的誘導作用并探討其相關機制。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器MTT、PBS、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechst33258染料購自Sigma公司；RIPA細胞裂解液、BCA試劑盒購自碧云天公司；一抗兔抗BAX、Bcl-2、Akt、p-Akt，二抗HRP標記山羊抗兔IgG(CST)及內參GAPDH購自康成生物有限公司。CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2細胞來源及培養方法人鼻咽癌細胞株HONE1購于中南大學湘雅中心實驗室，于廣西醫科大學實驗中心鼻咽癌實驗室液氮保存，傳代培養。細胞用含有10%胎牛血清(Gibco)和1%青鏈霉素溶液(索萊寶)的RPMI1640培養液于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱內常規培養。在細胞生長對數期時用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液(索萊寶)消化傳代。取對數生長期HONE1細胞株進行后續實驗。

1.3芒柄花黃素對細胞活性的影響觀察采用MTT法。將人鼻咽癌細胞株HONE1按照5 000個/孔均勻接種于96孔板內，恒溫箱內培養12 h待細胞貼壁后換液。用含不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)芒柄花黃素(購于天津士蘭科技有限公司，生產批號:20140516)的培養基分別培養人鼻咽癌細胞株HONE1 24、48、72 h(每組設置2個復孔，重復實驗3次)。再按20 μL/孔將預先配置好濃度為5 mg/mL的MTT溶液加入培養孔后將培養板置于恒溫培養箱內，繼續培養4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫避光震蕩10 min。最后在酶標儀上以490 nm波長檢測每孔的吸光度(A值)，計算細胞活性。細胞活性=實驗組A值/對照組A值。0、5、10、20、40、80、160 μmol/L芒柄花黃素處理人鼻咽癌細胞株HONE1 24 h的細胞活性分別為100%、89.5%、72.9%、47.4%、41.8%、35.8%、28.5%，48 h的細胞活性分別為100.0%、89.5%、64.4%、45.3%、38.6%、31.1%、27.7%，72 h的細胞活性分別為100.0%、81.1%、61.7%、38.0%、27.4%、21.8%、18.2%。芒柄花黃素對HONE1細胞增殖具有顯著抑制作用且具有濃度依賴性(P均<0.05)，但沒有明顯的時間依賴性(P均>0.05)。根據各組A值，參考趙斌等[8]提出的方法，計算出芒柄花黃素處理HONE1細胞不同時間段的半數抑制濃度(IC50)，24 h IC50為17.54 μmol/L，48 h IC50為28.09 μmol/L，72 h IC50為33.94 μmol/L。考慮到24 h內細胞處于適應階段，而72 h藥物作用時間較長，影響細胞生存狀態，因此本研究后續實驗均采用48 h為藥物作用時間。

1.4芒柄花黃素對細胞凋亡的影響觀察采用Hoechst33258法。將人鼻咽癌細胞株HONE1均勻接種于底面鋪有無菌處理后的蓋玻片的6孔板內，恒溫培養箱內培養12 h，待細胞貼壁后分別用不含芒柄花黃素的培養基(空白對照組)、40 μmol/L芒柄花黃素的培養基(實驗組)換液。在恒溫培養箱內繼續培養48 h后，棄去培養基，PBS潤洗后加入4%多聚甲醛常溫固定10 min。再用配置好的Hoechst33258工作液避光孵育10 min，PBS潤洗后，取出蓋玻片，用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5細胞BAX、Bcl-2、Akt、p-Akt蛋白檢測采用Western blotting法。將用含不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)芒柄花黃素的培養基分別培養48 h后的HONE1細胞，用PBS潤洗后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，4 ℃裂解30 min，高速離心后取上清液。再按照BCA試劑盒說明書測定總蛋白濃度后加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱5 min使蛋白變性后分裝，-20 ℃保存。取30 μg總蛋白經12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST潤洗后4 ℃孵育一抗過夜，次日在常溫搖床下孵育二抗(1∶10 000)。分別檢測Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、BAX(1∶2 000)、Bcl-2(1∶1 000)的蛋白，以GAPDH(1∶8 000)作為內參。ECL壓片顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，觀察蛋白相對定量。計算p-Akt/Akt值、BAX/Bcl-2值。

2結果

Hoechst33258熒光染色結果顯示，人鼻咽癌細胞株HONE1細胞核呈現藍色熒光，凋亡細胞核染色質固縮，呈顆粒狀或聚集，斷裂成片段。空白對照組(圖1A)藍色熒光分布較均勻，而實驗組(圖1B)呈現凋亡狀態的HONE1細胞數明顯增加。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細胞p-Akt/Akt值分別為0.311±0.035、0.169±0.029、0.116±0.038、0.143±0.012、0.082±0.015，5、10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。0、5、10、20、40 μmol/L芒柄花黃素處理48 h后HONE1細胞BAX/Bcl-2值分別為1.445±0.167、1.678±0.257、2.637±0.619、3.292±0.339、4.285±0.899，10、20、40 μmol/L與0 μmol/L比較，P均<0.05。

注：圖中箭頭所示為調亡細胞核。

圖1兩組凋亡細胞檢測(×200)

3討論

芒柄花黃素是富含于傳統中藥材黃芪側根的一種異黃酮類植物雌激素[9]。它對多種惡性腫瘤具有抗腫瘤效應。但不同腫瘤的發病機理不盡相同，研究芒柄花黃素對鼻咽癌的作用及其機制對于開發抗腫瘤新藥以及探尋藥物作用鼻咽癌效應靶點都具有深遠意義。本研究通過MTT實驗證實芒柄花黃素對鼻咽癌細胞株HONE1具有顯著的增殖抑制效應。

細胞凋亡在惡性腫瘤的發生、發展中占有重要地位，凋亡信號通路是當前抗腫瘤研究的熱點[10]。本研究Hoechst33258染色結果顯示，芒柄花黃素能誘導HONE1細胞凋亡，與MTT結果相吻合，芒柄花黃素是通過誘導細胞凋亡而抑制HONE1細胞增殖。經典的細胞凋亡途徑包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族主導的內質網凋亡途徑；腫瘤壞死因子受體家族主導的死亡受體凋亡途徑以及Bcl-2家族主導的線粒體凋亡途徑。其中，線粒體凋亡途徑與化療藥物抗腫瘤作用關系密切[11]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2基因發揮抗凋亡作用，而BAX作用則相反，同時該凋亡途徑受上游信號通路調控[10]。磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路與細胞的增殖、分化、代謝等關系密切，其中Akt的活化在鼻咽癌的進展和侵襲轉移中發揮重要作用[12]。PI3K/Akt信號通路能夠通過多種途徑發揮抗凋亡作用，在鼻咽癌、卵巢癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤中失調。抗腫瘤藥物可通過靶向抑制PI3K/Akt信號通路而發揮抗腫瘤效應。本研究結果顯示，芒柄花黃素呈濃度依賴性下調Akt磷酸化水平并增大BAX/Bcl-2。因此，我們推測芒柄花黃素可能通過作用PI3K/Akt信號通路激活線粒體凋亡途徑而誘導HONE1細胞凋亡。

綜上所述，芒柄花黃素可誘導人鼻咽癌細胞株HONE1細胞凋亡，這可能是通過下調p-Akt/Akt、上調BAX/Bcl-2實現的。

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Induction of formononetin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 and its mechanism

QIChenglin,LIANGJuan,LIHeng,YANGXuemin,TANGAnzhou

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the induction of formononetin on apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1 and to investigate its mechanism.MethodsHONE1 cells were cultured with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160 μmol/L) for separated time (24, 48 and 72 h). Cell viability of HONE1 was examined using an MTT assay. The apoptosis of HONE1 cells from morphological changes after being treated with formononetin was examined by Hoechst33258 assay. The proteins (p-Akt, Akt, BAX and Bcl-2) of HONE1 cells were tested by Western blotting after being treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h. ResultsHoechst33258 fluorescence staining showed that the number of apoptosis of HONE1 cells was increased after being treated with formononetin as compared with the cells without treatment. The p-Akt/Akt values of HONE1 cells which were treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h were 0.311±0.035, 0.169±0.029, 0.116±0.038, 0.143±0.012 and 0.082±0.015, respectively. Significant difference was found between 0 μmol/L and 5, 10, 20 and 40 μmol/L (all P<0.05). The BAX/Bcl-2 values of HONE1 cells which were treated with different concentrations of formononetin (0, 5, 10, 20 and 40 μmol/L) for 48 h were 1.445±0.167, 1.678±0.257, 2.637±0.619, 3.292±0.339 and 4.285±0.899, respectively. Significant difference was found between 0 μmol/L and 10, 20 and 40 μmol/L (all P<0.05).ConclusionFormononetin can induce the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line HONE1, which may be mediated by down-regulating p-Akt/Akt and up-regulating BAX/Bcl-2.

Key words:formononetin; nasopharyngeal carcinoma; apoptosis; Bcl-2

(收稿日期：2015-12-05)

中圖分類號：R979.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)11-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.002