自體多免疫細胞療法聯合恩替卡韋治療慢性乙型活動性肝炎的短期療效觀察

俞哲 劉軍權 李佳佳 王琛 王飛 李曉鷗 駱欣

[摘要] 目的 探討多種自體免疫細胞與恩替卡韋聯合治療慢性乙型活動性肝炎的抗病毒療效。 方法 將2015年4～9月我院收治的慢性活動性乙型病毒性肝炎患者26例分為兩組（對照組和聯合治療組），兩組均予以抗病毒治療，其中聯合治療組12例接受多細胞免疫療法聯合恩替卡韋治療，對照組14例單用恩替卡韋治療。并分離單核細胞，體外培養γδ T細胞、NK細胞、NKT細胞，治療8～12周后評價其療效。 結果 治療前兩組患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比較無統計學差異，聯合治療組HBsAg下降速率（治療前/治療后）與對照組比較有統計學差異（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治療前后，聯合治療組下降幅度大于對照組，但差異無統計學意義（P>0.05）；而HBeAg兩組對比無顯著性差異。聯合組不良反應輕微。 結論 自體多免疫細胞療法聯合恩替卡韋可促進HBsAg清除，對HBV的清除可能有幫助。

[關鍵詞] 自體免疫細胞；NK細胞；NKT細胞； γδT細胞；恩替卡韋；慢性乙型病毒性肝炎

[中圖分類號] R575.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）06-0022-04

Study on the short-term efficacy of autologous immune cell therapy combined with entecavir in the treatment of chronic hepatitis B

YU Zhe LIU Junquan LI Jiajia WANG Chen WANG Fei LI Xiaoou LUO Xin

Department of Liver Disease of the Hangzhou Xixi Hospital， Hangzhou Sixth People's Hospital， Hangzhou 310023，China

[Abstract] Objective To evaluate the efficacy of treatment for hepatitis B virus combined entecavir with a variety of autoimmune cells. Methods 26 hospital patients with chronic hepatitis B were divided into two groups（control group and combination treatment group） voluntarily during the period from April to September in 2015. All patients were in accordance with the indications for anti viral treatment. The combination treatment group included 12 patients received treatment combined entecavir with a variety of autoimmune cells and the control group involved 14 patiens accepted treatment of entecavir alone. Mononuclear cells were isolated， γδ T cells， NK cells， NKT cells were cultured in vitro. The efficacy of the two groups were evaluated after 8-12 weeks. Results There were no statistically significant differences in ALT， HBsAg， HBeAg， HBV DNA between the two groups before treatment. There were significant differences in the decrease rate of HBsAg（before/after treatment） between the two groups（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）； The efficacy of treatment group was greater than the control group in ALT， HBV DNA， but there was no statistically significant difference（P>0.05）. There was no significant difference between the two groups in the inhibition of HBeAg. Adverse reactions in the treatment group were mild. Conclusion Multicellular autologous immunotherapy combined with entecavir could promote removal of HBsAg. Multicellular autologous immunotherapy may be helpful to the removal of HBV.

[Key words] Autologous immune cells； NK cell； NKT cell； γδT cell； Entecavir； Chronic hepatitis B

多免疫細胞療法是一群具有較強免疫活性的細胞聯合治療相應疾病的簡稱，主要包括病毒特異性CTL、NK細胞、γδT細胞、NKT細胞等多種細胞。其中NK細胞與NKT細胞是肝臟固有免疫應答反應中的主要淋巴細胞，這兩種細胞約占肝臟淋巴細胞的50%。當HBV急性感染時，肝臟內的NKT能直接激活細胞防御基因家族，誘導β干擾素的分泌，直接抑制病毒DNA復制[1-4]。γδT細胞介于固有和適應性免疫的T細胞，是免疫防御的第一防線，具有免疫調節、參與多種細菌與病毒的免疫應答等作用[5]。提高機體的T淋巴細胞和抗原提呈細胞的細胞免疫功能及增加協同細胞因子等多種方法聯合對于清除病毒、打破免疫耐受將起到重要的作用[6]。恩替卡韋（entecavir，ETV）是目前最常用的核苷酸類抗病毒藥物，由于具有抗病毒效果迅速、耐藥率低等特點而廣泛應用于臨床[7]。但核苷類似物只能抑制HBV DNA復制，并不能徹底清除乙肝病毒[8]，致使患者需要多年服用抗病毒藥物。多種免疫細胞，對于提高患者固有免疫和針對HBV的特異性免疫功能有幫助，與恩替卡韋聯合應用，有可能促進HBV的清除。本研究收集自體多免疫細胞聯合恩替卡韋治療慢性乙型活動性肝炎患者資料，與單用恩替卡韋治療為對照，初步分析療效、不良反應等臨床資料，現將前期研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2015年4～9月我院收治的慢性活動性乙型病毒性肝炎患者26例，符合“2012年中華醫學會肝病學分會、感染病學分會制定的《乙型肝炎防治指南》”中的診斷標準和抗病毒治療適應證，排除非活動性HBsAg攜帶者/慢性HBV攜帶者、合并其他肝損疾患（其他嗜肝病毒重疊感染、藥物性、酒精性、自身免疫性、代謝性等）、失代償期肝硬化、肝功能衰竭、活動性出血、重要臟器功能障礙、出凝血功能障礙、妊娠、正在使用免疫抑制藥物，或器官移植后長期使用免疫抑制劑等患者。經知情告知，患者自主選擇，分為恩替卡韋、自體多免疫細胞聯合治療組12例，男10例，女2例，年齡（37.41±7.54）歲；單用恩替卡韋對照組（ETV組）14例，男12例，女2例，年齡（35.36±8.26）歲。兩組患者在性別、年齡方面比較，無統計學差異，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均符合抗病毒治療適應證，經知情告知，患者均選擇恩替卡韋分散片（正大天晴藥業有限公司，0.5 mg/片：國藥準字H20100019）0.5 mg口服，1次/d，抗病毒治療。

1.2.2 觀察指標 兩組患者在抗病毒治療前1～3 d晨起空腹采血檢測血常規、生化、乙肝三系、HBV DNA等指標，聯合治療組患者同時機采外周血150 mL進行分離、定向培養。治療后8～12周對兩組患者上述指標進行復檢。

1.2.3 自體多免疫細胞分離、培養、回輸操作方法

1.2.3.1 單核細胞的分離 機采患者外周血150 mL，轉入50 mL離心管，離心2000 rpm，10 min，吸取血漿等分為6份，凍存于-80℃冰箱，供回輸細胞時使用；預先將淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque1077，加入50 mL無菌離心管，20 mL/管（分離單個核細胞）；吸取生理鹽水將吸取血漿后的標本還原至原始體積，混勻，緩慢加在Ficoll-Hypaque1077上，體積比為1∶1～1.5。600 rpm，室溫離心20 min（注意調整離心機加速和減速過程為最低）；用平口巴氏滴管輕輕插入到單個核細胞層，沿著管壁吸取該層，每管加生理鹽水至50 mL，輕輕吹勻細胞，離心洗滌3次，除去血小板和分離介質。棄去上清，用無血清1640培養液重懸計數；將分離得到的單核細胞進行分成3份，分別用作γδT細胞、NK細胞、NKT細胞的培養。

1.2.3.2 γδT細胞的培養 取1.2.3.1步驟獲得的PBMC細胞一份，以細胞濃度1×106/mL加入適量細胞培養基，并加入預刺激因子：A1、自體血漿10%；在培養的第2天加入A2和A3，第3天再加入A4，3 d以后視培養情況補液或傳代，第13天收集細胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第1天回輸共2次。

1.2.3.3 NK細胞的培養 取1.2.3.1步驟獲得的PBMC細胞一份，以細胞濃度1×106/mL加入適量細胞培養基，并加入預刺激因子：E1、自體血漿10%；在培養的第2天加入E2，第3天再加入E3、E4、E5，3 d以后視培養情況補液或傳代，第14天收集細胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第2天回輸共2次。

1.2.3.4 NKT細胞的培養 取步驟1.2.3.1 PBMC細胞一份，以細胞濃度1×106/mL加入適量細胞培養基，并加入預刺激因子：B1、自體血漿10%；在培養的第2天加入B2，第3天再加入B3、B4，3 d以后視培養情況補液或傳代，第15天收集細胞，生理鹽水洗滌3次，用含有10%患者自身血漿的生理鹽水重懸浮，總體積為200 mL，靜脈回輸患者，第3天回輸共2次。

1.2.3.5 細胞的質量控制 細胞培養至第7天，取樣進行細菌學培養；每次回輸前1 h通過凝膠法進行細菌內毒素檢查。細胞2℃～6℃冷鏈運輸，2 h內回輸患者體內，并記錄每次輸注細胞后有無寒戰、發熱及過敏等癥狀。

1.2.3.6 細胞回輸過程中的護理 制備好的細胞懸液灌裝于生理鹽水中，體積為100 mL，用一次性輸血器靜脈滴注，速度40滴/min，為避免細胞堵塞輸血器管腔或黏附管壁，輸注完畢后用20 mL生理鹽水沖洗輸液瓶和管道。在細胞輸注過程中，由專職護士全程負責，嚴格遵守無菌技術操作原則，如有不良反應，及時匯報醫生處理。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件進行處理，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩樣本比較采用t檢驗；偏態分布計量資料以中位數（25分位數，75分位數）M（P25，P75）表示，兩樣本比較采用非參數秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前情況比較

治療前兩組患者在ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA比較無統計學差異。見表2。

2.2 兩組治療后情況比較

聯合治療組HBsAg下降速率（治療前/治療后）與對照組比較有統計學差異，提示自體多免疫細胞療法聯合恩替卡韋對HBsAg抑制程度顯著高于單用恩替卡韋組（4.15±0.86 vs 1.80±0.15，t=2.09，P<0.05）；ALT、HBV DNA在治療前后，聯合治療組下降幅度大于對照組，但無統計學意義；而HBeAg兩組對比無統計學差異。見表3。

2.3 不良反應

本研究過程中，每次回輸后密切臨床觀察半小時以上，12例患者僅有1例患者在細胞回輸時輕微發熱，經密切觀察，未予特殊處理，2～4 h內體溫恢復正常，其余患者無明顯不良反應。

3 討論

研究表明慢性乙肝的整個病程進展與HBV持續感染所導致的機體免疫功能障礙有著較緊密的關系[9]。其他大多數患者通常采用核苷類似物或/和IFN-α抗病毒治療，雖然具有一定的臨床療效，但均難以徹底清除病毒[6]。同時有研究發現，部分擁有健全的免疫功能感染者可以依靠較強的免疫力將病毒清除而獲得痊愈[10]。肝臟中NK、NKT及γδT細胞等非特異性免疫細胞含量豐富，可占全部肝臟淋巴細胞的2/3，在抗HBV感染免疫中起到了很重要的作用[2-4]，有研究表明[11]乙肝患者外周血來源的γδT細胞存在某些免疫功能的降低，其可能是乙肝慢性化的重要因素。而其他研究表明經誘導培養的γδT細胞可高分泌IFN-γ和GM-CSF等細胞因子，并經過經過二次分布，聚集于肝臟組織內，通過IFN的旁分泌對整合于肝細胞中的HBV DNA進行直接抑制和清除對于提高機體病毒清除率，同時建立肝臟局部的免疫平衡有著重要的意義[12，13]。而NK和NKT細胞作為肝臟固有免疫應答反應中的主要淋巴細胞，在感染HBV時，能誘導干擾素β的分泌，直接抑制病毒DNA的復制[15]，更有研究表明γδT 細胞可能直接參與了HBV急性感染與清除的過程[16]。康海燕等[17]利用DC-CIK聯合干擾素治療慢性乙型肝炎時，聯合治療組肝功能改善、HBV DNA下降明顯優于干擾素治療組，應用免疫細胞和核苷酸類似物聯合抗病毒治療可打破免疫耐受，維持機體的免疫平衡，將利于HBV DNA的清除。本研究中，聯合治療組ALT、HBV DNA下降幅度略大于單行恩替卡韋治療結果，雖無明顯差異（P>0.05），但也提示多細胞治療有可能在輔助降低HBV病毒量及改善肝功能上有重要作用。

本研究中發現恩替卡韋在聯合多細胞治療結果發現，聯合組的HBsAg下降幅度明顯優于單恩替卡韋組。HBsAg是HBV的外膜蛋白，通過HBV表面基因轉錄和翻譯形成，在病毒感染肝細胞過程中其重要作用，HBsAg與肝內cccDNA密切相關，HBsAg定量檢測能較好的反應HBV的復制狀態，對接受核苷類抗病毒治療HBV DNA陰轉后的進一步療效觀察具有重要的臨床意義[18]。黃躍雁等[19]研究認為，HBsAg的初始水平和中間下降水平均可作為干擾素治療HBeAg陽性慢性乙肝的早期預測標志，若HBsAg下降較快預示有較好的預后，反之則需要延長治療時間或聯合其他藥物治療。HBsAg下降幅度越大，HBeAg抗原的血清學轉換發生率就越高。上述研究均說明了抗病毒治療期間，HBsAg下降幅度與預后有較大的聯系，提示多細胞聯合恩替卡韋有可能在縮短抗病毒治療時間，提高預后效果上有重要意義。

在安全性方面，除在回輸過程中出現1例一過性發熱外，未出現其他明顯不良反應[20]。本研究初步顯示了多細胞聯合核苷酸類似物在治療乙型肝炎上的可行性和有效性，但由于研究隨訪時間短，患者樣本量較少，仍需要進一步開展大樣本研究加以驗證。

[參考文獻]

[1] Arababadi MK，Pourfathollah AA，Jafarzadeh A，et al. Evaluation of CCR5 expression on NK cells in Iranian patients with occult hepatitis B infection[J]. Laboratory Medicine，2010，41（12）：735-738.

[2] Vivier E，Tomasello E，Baratin M，et al. Functions of natural killer cells[J]. Nature Immunology，2008，9（5）：503-510.

[3] Welsh RM，Waggoner SN. NK cells controlling virus-specific T cells：Rheostats for acute vs. persistent infections[J].Virology，2013，435（1）：37-45.

[4] Dong Z，Wei H，Rui S，et al. The roles of innate immune cells in liver injury and regeneration[J]. Cellular & Molecular Immunology，2007，04（4）：241-252.

[5] Willi K，Born，Zhinan，et al. Analysis of gamma delta T cell functions in the mouse[J]. Journal of Immunology，2010，184（8）：4055-4061.

[6] 劉慶德，王洪旗，劉軍權，等. 自身γδT細胞治療乙型肝炎的臨床觀察[J]. 中國醫藥導報，2013，10（21）：27-30.

[7] 黃強. 拉米夫定聯合阿德福韋酯與恩替卡韋治療乙肝肝硬化的療效對比分析[J]. 廣西醫學，2014，36（7）：980-982.

[8] Massimo L，Teresa P，Jorg P，et al. Control of cccDNA function in hepatitis B virus infection[J]. Journal of Hepatology，2009，51（3）：581-592.

[9] 李俊卿，周俊英. 免疫細胞在慢性乙型肝炎免疫耐受機制中的作用[J]. 臨床肝膽病雜志，2011，27（4）：437-440.

[10] Kobayashi M，Hosaka T，Suzuki F，et al. Seroclearance rate of hepatitis B surface antigen in 2，112 patients with chronic hepatitis in Japan during long-term follow-up[J]. Journal of Gastroenterology，2014，49（3）：538-546.

[11] 韓聚強，徐小潔，葉棋濃. γ/δT細胞與丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒感染[J]. 生物技術通訊，2012，23（1）：120-122.

[12] Chen M，Hu P，Peng H，et a1.Enhanced peripheral γδT cells cytotoxicity potential in patients with HBV-associated acute-on-chronic liver failure might contribute to the disease progression[J].J Clin Immunol.2012，32（4）：877-885.

[13] 劉旺霞，趙景民，王福生，等. 免疫活性細胞在自身免疫性肝炎發病機制中的意義[J]. 解放軍醫學雜志，2003， 28（2）：151-153.

[14] 桂萬羊，馬勇，賀瀟. 異戊烯焦磷酸對慢性乙型肝炎患者外周血γδT細胞增殖及干擾素γ分泌的影響[J]. 實用醫學雜志，2010，26（17）：3087-3089.

[15] Heiberg IL，Pallett LJ，Winther TN，et al. Defective natural killer cell anti-viral capacity in paediatric HBV infection[J]. Clin Exp Immunol，2015，179（3）：466-476.

[16] 常琳，王磊，彭輝，等. γδT細胞在急性乙型肝炎病毒感染小鼠模型中的變化分析[J]. 中國免疫學雜志，2014， 30（1）：18-23.

[17] 康海燕，王建彬，董江龍，等. 自體DC、CIK回輸聯合干擾素治療慢性乙肝的臨床觀察[J]. 山東醫藥，2011， 51（45）：55-56.

[18] 陳璐，郭斯敏，莊焱，等. 聯合聚乙二醇干擾素-α對恩替卡韋經治HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的療效和預測因素[J]. 肝臟，2015，20（6）：434-437.

[19] 黃躍雁，張學敏，劉金霞，等. HBsAg定量預測干擾素治療e抗原陽性慢性乙型肝炎的遠期療效[J]. 山東醫藥，2010，50（32）：8-9.

[20] Fan Y，Wei F，Shu Y，et al.Effect of dendritic cells-cytokine-induced killer cell autologous immune cell therapy on serum microRNA-29a of metastatic colorectal cancer patients[J].Chin J Exp Surg，2014，31（10）：2290-2292.

（收稿日期：2015-12-22）