氧化損傷誘導的人晶狀體上皮細胞系基因表達譜的差異和表型改變

梅　林，王　嵩，閆　博，楊安鋼，趙　晶，嚴　宏

?

·實驗論著·

氧化損傷誘導的人晶狀體上皮細胞系基因表達譜的差異和表型改變

梅林1，王嵩1，閆博2，楊安鋼2，趙晶2，嚴宏1

Citation:Mei L, Wang S, Yan B,etal. Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(5):822-825

摘要

目的：探討人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells，HLEC)氧化刺激后基因表達譜的差異以及相應的表型改變。

方法：培養人晶狀體上皮細胞系HLE-B3并給予H2O2刺激。24h后，提取細胞總RNA進行基因表達譜芯片檢測，并采用生物信息學數據庫DAVID對氧化刺激組相比對照組顯著上調的基因進行Gene Ontology(GO)功能富集分析。RT-qPCR對上調的基因進行驗證。通過MTT和流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

結果：表達譜芯片結果顯示，氧化刺激造成HLEC中367個基因上調，GO分析表明這些基因富集于310個功能類別中，主要包括p53信號通路、細胞凋亡通路、細胞程序性死亡通路等。RT-qPCR結果證實，6個主要參與促凋亡或抗凋亡調節的基因，包括BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2和BCL2L1，在氧化刺激后表達水平明顯上升。MTT實驗和流式細胞儀檢測結果顯示，H2O2刺激后HLEC凋亡逐漸上升，是細胞氧化損傷的主要表現。

結論：氧化刺激可同時誘導HLEC中促凋亡基因和抗凋亡基因表達水平上調，但最終仍然導致了細胞凋亡。

關鍵詞：人晶狀體上皮細胞；氧化損傷；表達譜芯片；細胞凋亡

引用：梅林，王嵩，閆博，等.氧化損傷誘導的人晶狀體上皮細胞系基因表達譜的差異和表型改變.國際眼科雜志2016;16(5):822-825

0引言

晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LEC)是晶狀體抵抗氧化損傷、維持正常生理功能的重要防線。健康的LEC可合成抗氧化物及抗氧化酶，調節晶狀體內環境，修復受損細胞及蛋白質等，LEC的生理狀態對于保持晶狀體透明性至關重要[1-2]。然而，來自外界環境的刺激如紫外線照射、外傷或手術引起的局部炎癥以及糖尿病高血糖等都會對LEC造成損害，而其中一個共同途徑就是這些有害因素均能造成細胞內活性氧簇分子(reactive oxygen species，ROS)增加，包括H2O2、O2-和·OH。當ROS的累積超出人晶狀體上皮細胞(HLEC)的清除能力時，就會引起細胞的氧化損傷，使細胞新陳代謝失常，進而導致白內障形成[3]。既往研究表明，氧化損傷對細胞的影響涉及到細胞的生長、增殖、分化、凋亡等諸多方面，因此研究HLEC經受氧化損傷后最主要的表型變化并探索其阻斷策略，對進一步了解白內障發病機制、尋找預防或治愈白內障的治療方法具有重要意義。

1材料和方法

1.1材料人晶狀體上皮細胞系HLE-B3來自中山大學眼科研究中心惠贈。DMEM低糖培養基、胎牛血清(美國HyClone公司)，胰蛋白酶(上海碧云天公司)，Affymetrix Prime View表達譜芯片(美國Affymetrix公司)，Trizol試劑(日本TaKaKa公司)，逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司)，實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒(德國Qiagen公司)，RT-qPCR熒光探針(日本TaKaRa公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)，分光光度計(美國Bio-Rad公司)，實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組人晶狀體上皮細胞復蘇后培養于6cm皿中，加入4mL含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基，內含105U/L青霉素和105g/L鏈霉素。細胞置于37℃、含體積分數50mL/L CO2恒溫培養箱內培養，細胞生長至80%融合狀態時，向培養基中加入濃度為70μmol/L H2O2作為氧化損傷組，對照組細胞不予處理。24h后，使用Trizol提取細胞總RNA。

1.2.2表達譜芯片檢測總RNA樣品經Agilent Bioanalyzer 2100電泳進行質檢，合格的RNA樣品采用Affymetrix表達譜芯片配套試劑盒，根據標準操作流程對樣品RNA中的mRNA進行放大、標記和純化，獲得帶有生物素標記的cRNA。雜交時，采用雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中45℃，16h滾動雜交，并在洗滌工作站按照標準流程進行芯片的洗滌。采用GeneChip Scanner 3000對芯片結果進行掃描，采用Command Console Software 4.0讀取原始數據，采用Gene Spring Software 11.0中的RMA算法對質控合格的數據進行歸一化處理[1,4]。

1.2.3 Gene Ontology分析根據表達譜芯片結果，將氧化損傷組相比于對照組表達量比值>2.0者定義為上調差異基因，并采用DAVID數據庫(http://david.ncifcrf.gov/)，對差異基因進行Gene Ontology(GO)功能富集分析。應用Fisher精確概率法找出差異基因中，相比整個基因組背景相比，顯著富集的基因功能分類。P<0.05的功能分類定義為在差異基因中顯著富集。

1.2.4 RT-qPCR檢測使用Trizol提取各組細胞總RNA，分光光度計對RNA樣品質檢并定量。使用逆轉錄試劑盒，根據操作流程獲取cDNA，并進行RT-qPCR檢測，反應體系為20.0μL：熒光探針10.0μL、上下游引物各1.0μL、cDNA模板2.0μL、去離子水6.0μL。反應條件：第一步95℃，3min；第二步95℃，10s；第三步55℃，15s；第四步72℃，15s。其中第二步到第四步設40個循環[1]。BCL2A1：上游，5’-GCAGTGTGGTCTCCGAATGTCT-3’；TP53I3：上游，5’-AAGGAAATAACCACCATGTTAGCCGTGCAC-3’[5]；FAS：上游，5’-CTACCTAAGAGCTATCTACCGTTC-3’[6]；ZMAT3：上游，5’-ATGATCCTCTTGCAACACG-3’[7]；DDB2：上游，5’-TCACTTCCAGCACCTCACAC-3’；BCL2L1：上游，5’-GGACAGCATATCAGAGCTTTGAACA-3’[8]；GAPDH作為內參：上游，5’-TCACCAGGGCTGCTTTTAAC-3’。所有下游引物均采用RT-qPCR試劑盒中的通用引物。

1.2.5 MTT實驗將HLE-B3以5000/孔接種于96孔板，常規培養至80%孔底面積，吸出培養液，加入含70μmol/L H2O2的新配培養液，分別于12、18、24、36h后，進行MTT實驗，方法為：每孔加入5mg/mL MTT溶液，培養4h后，吸出廢液，每孔加入150μL DMSO，置搖床上低速搖勻10min，使結晶物充分溶解。在酶標儀490nm處測量各孔的吸光值。每個濃度設5個復孔。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡以同樣方法對HLE-B3進行H2O2刺激。24h后，收集氧化損傷組和對照組細胞，PBS洗滌后重懸。根據凋亡檢測試劑盒的使用說明，對細胞分別進行Annexin V-FITC和PI染色，使用流式細胞儀分選細胞，并分析最終結果。

統計學分析：應用SPSS 18.0統計軟件進行處理。計量資料以均值±標準差表示，數據以常氧組與低氧組間相對比值表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1氧化損傷組與對照組的mRNA表達譜差異表達譜芯片中顯著上調基因篩選標準：氧化損傷組表達量與對照組表達量比值>2.0。根據這一標準，表達譜芯片結果顯示，H2O2刺激誘導氧化損傷共引起367個mRNA表達上調，部分結果見表1。功能富集分析結果顯示，上調的基因富集于310個相關分類中，富集值最高的分類為p53信號通路、細胞凋亡通路、細胞程序性死亡通路等(圖1)。

2.2表達譜芯片結果驗證經RT-qPCR對BCL2A1、TP53I3、FAS、ZMAT3、DDB2、BCL2L1表達水平進行檢測，結果見表2。這些數據表明，氧化損傷發生后，此6個基因表達水平相比對照組顯著提高(圖2)，實驗結果與表達譜芯片結果相吻合。

2.3氧化損傷誘導HLEC細胞發生凋亡MTT實驗結果表示，HLE-B3細胞經過H2O2刺激后，隨著時間延長，細胞凋亡逐漸增加，直至氧化刺激后36h，僅7%細胞存活(圖3)。Annexin V-FITC/PI染色后流式細胞儀分析顯示，H2O2刺激后24h，存活細胞約占25%，而凋亡細胞比例達到57%，其結果與MTT實驗大致相符(圖4)。

3討論

圖1實驗組相比對照組上調差異基因的聚類分析(氧化損傷在細胞凋亡、程序性死亡通路、細胞活力等310個分類中有最高差異值)。

大量研究表明，ROS是晶狀體混濁及白內障發病的罪魁禍首。正常情況下，ROS可以被細胞內的抗氧化系統及時清除，但是當ROS產生增加，或衰老等因素導致細胞抗氧化能力減弱時，ROS就會在體內累積，造成氧化損傷[9]。

表1氧化損傷后顯著上調的基因

基因ID英文縮寫英文全稱上調比值NM_153361IL8Interleukin86.80NM_006516BCL2A1B-celllymphoma2-relatedproteinA15.78NM_018689TP53I3Tumorproteinp53inducibleprotein35.59NM_020768FASFas(TNFreceptorsuperfamily,member6)5.08NM_022470ZMAT3Zincfinger,matrin-type33.48NM_004994MMP9Matrixmetallopeptidase93.20NM_000089LCE1FLatecornifiedenvelope1F3.10NM_001001669SAT1Spermidine/spermineN1-acetyltransferase13.09NM_006252KANK3KNmotifandankyrinrepeatdomains33.05NM_030915DDB2Damage-specificDNAbindingprotein22.95NM_000302RRM2BRibonucleotidereductaseM2B2.92NM_001191BCL2L1B-celllymphoma2-like12.76NM_001025366CASP1Caspase1,apoptosis-relatedcysteinepeptidase2.69NM_000610CD44CD44molecule2.51

圖2RT-qPCR驗證過氧化氫刺激后所選基因mRNA水平提高bP<0.01vs對照組。

圖3氧化刺激后，HLEC存活率隨著時間推移逐漸下降。

表2氧化損傷后高表達基因RT-qPCR驗證結果

±s

圖4過氧化氫處理24h后HLEC的凋亡水平。

本研究利用表達譜芯片對氧化損傷后HLEC基因表達水平的變化進行了檢測，結果顯示，氧化損傷組367個基因的表達水平相比于對照組明顯上調。通過GO分析，我們發現顯著上調的差異基因大部分位于細胞凋亡或程序性死亡相關信號通路中。由此推測，凋亡可能是氧化損傷對HLEC的最主要影響。首先，p53信號通路的激活最為顯著。p53是目前研究相對明確的抑癌基因，它可以通過阻斷細胞周期、加速細胞衰老、誘導細胞凋亡等方式抑制腫瘤細胞的生長和轉移[10]。有研究表明，p53相關凋亡通路對調控HLEC凋亡以及白內障的生成具有重要作用[11]。本研究發現，表達水平上調的p53下游基因中，以TP53I3和FAS較為典型。TP53I3是DNA損傷應答(DDR)系統中的一員，當DNA發生輕度損傷時，可激活TP53I3，參與受損DNA的修復。同時，DDR系統會活化p53，一方面可以阻斷細胞周期來配合DNA損傷的修復，另一方面p53可以誘導產生更多活化的TP53I3，但這一過程會產生少量ROS。因此當外界刺激造成DNA嚴重損傷時，就會引起p53極端過表達并激活更多下游基因與TP53I3相互作用，導致ROS累積，最終啟動細胞凋亡信號通路，如FAS[12]。FAS是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，也是p53誘導細胞凋亡的下游調控基因，當配體FasL與受體FasR結合后，會通過銜接蛋白活化起始caspase，再經過caspase酶家族的其他成員將信號逐級放大傳播，最終啟動凋亡程序[13]。由此我們推測，本研究中，當HLEC經歷氧化刺激后，TP53I3的高表達一方面代表了DDR系統的激活，另一方面也意味著p53依賴的促凋亡信號通路的啟動，而FAS的高表達可能直接導致了細胞的程序性死亡。其次，在諸多促凋亡基因高表達的同時，我們注意到，一些抑制凋亡基因的表達水平也有著明顯上升，如ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1。其中ZMAT3也是p53的下游基因之一。p53可以誘導ZMAT-3產生一種鋅指蛋白，并作用于p53的下游基因如FAS，起到加速其mRNA降解的作用，抑制細胞凋亡[14]。除了ZMAT3、BCL2A1和BCL2L1作為BCL2家族抗凋亡分子中的成員，其高表達可能也對抑制HLEC凋亡起重要作用。線粒體外膜透化并釋放細胞色素C是細胞凋亡通路中的重要環節，而這一環節的啟動源于BH3-only蛋白(BCL2 homology domain 3-only protein)與線粒體外膜的BAX、BAK受體結合，BCL2家族的抗凋亡分子可以與BH3-only蛋白作用使其失活，或競爭性結合BAX和BAK，從而阻斷細胞色素C的釋放，抑制細胞凋亡[15]。由此可見，HLEC氧化損傷后，促凋亡基因與抗凋亡基因均有上調，而二者拮抗的結果將決定細胞的命運。因此，我們對H2O2氧化刺激后細胞的凋亡水平進行了檢測。MTT實驗表示，細胞經H2O2處理12h時，仍有85%細胞存活，隨后存活細胞數量逐漸減少，由此推測細胞的損傷修復和抗凋亡系統在氧化刺激初期可修復部分損傷、抵抗凋亡信號通路。隨著時間的推移，由于氧化損傷較為嚴重，細胞的修復功能無法代償，于是更多細胞發生凋亡。流式細胞儀分析結果也表示，H2O2后24h，約75%細胞死亡，其中超過70%細胞發生了凋亡，壞死細胞僅占不到30%，說明大多數細胞的死亡源于氧化刺激后凋亡程序的啟動。

綜上所述，細胞凋亡是HLEC發生氧化損傷后的重要表現，這一過程涉及多個凋亡和抗凋亡信號通路的調節。未來我們將對這些通路中的關鍵分子進行更為詳細的研究，以進一步了解細胞凋亡在白內障發病過程中的作用，并為臨床上通過抑制HLEC細胞凋亡以預防或治療白內障提供理論依據。

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Discrepant gene expression profile and phenotype changes in human lens epithelial cells after oxidative damage

Lin Mei1, Song Wang1, Bo Yan2, An-Gang Yang2, Jing Zhao2, Hong Yan1

Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No. 81370997)

1Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China;2Department of Biochemistry and Molecular Biology, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Correspondence to:Hong Yan. Department of Ophthalmology, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, Shaanxi Province, China. yhongb@fmmu.edu.cn

Received：2016-02-22Accepted：2016-04-11

Abstract

?AIM:To explore the discrepant gene expression profiles and the related phenotype changes in human lens epithelial cells(HLEC) after oxidative stimulation.

?METHODS:Human lens epithelial cell line(HLE-B3) were cultured in normal condition or with H2O2for 24h. Total RNA were extracted for gene expression profiling assay and gene ontology analysis was performed for the significantly up-regulated genes using bioinformational database DAVID. The elevated expressions of up-regulated genes in HLEC after oxidative stimulation were confirmed by RT-qPCR. The apoptosis of HLEC induced by oxidative damage was detected using 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT) assay and flow cytometry.

?RESULTS:Gene expression profiling assay demonstrated that 367 genes were up-regulated in HLEC after oxidative stimulation. These genes were enriched in 310 biological processes mainly associated with p53-related signaling pathways, apoptosis, programed cell death and etc. Six genes mainly pro- or anti-apoptotic, including BCL2A1,TP53I3,FAS,ZMAT3,DDB2 and BCL2L1, were confirmed to be up-regulated by oxidative stimulation using RT-qPCR(P<0.05). Results of MTT assay and flow cytometry showed that apoptosis of HLEC gradually appeared after cells were treated with H2O2and became the main consequence of oxidative stimulation.

?CONCLUSION:Oxidative stimulation can induce up-regulation of proapoptotic genes and lead to apoptosis of HLEC, even though antiapoptotic genes can also be promoted.

KEYWORDS:?human lens epithelial cells;oxidative damage;gene expression profile;apoptosis

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.5.07

收稿日期：2016-02-22 修回日期： 2016-04-11

通訊作者：嚴宏，主任醫師，教授，博士研究生導師，研究方向：白內障、小兒眼病.yhongb@fmmu.edu.cn

作者簡介：梅林，在讀博士研究生，研究方向：白內障。

基金項目：國家自然科學基金(No.81370997)
作者單位：
1(710038)中國陜西省西安市，第四軍醫大學唐都醫院眼科；
2(710032)中國陜西省西安市，第四軍醫大學基礎部生物化學與分子生物學教研室