纈沙坦氨氯地平片有關物質研究

周志勇，黃鶴飛，張　燁

(1.三峽大學醫學院藥學系;2.三峽大學第一臨床醫學院藥劑科，湖北 宜昌　443003)

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◇藥物分析◇

纈沙坦氨氯地平片有關物質研究

周志勇1，黃鶴飛2，張燁2

(1.三峽大學醫學院藥學系;2.三峽大學第一臨床醫學院藥劑科，湖北 宜昌443003)

摘要：目的建立纈沙坦氨氯地平片有關物質含量的測定方法。方法采用高效液相色譜法，Agilent1220高效液相，(Eclipse plus，250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B，進行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL·min(-1)，檢測波長為237 nm。結果氨氯地平與雜質D分離度為14.44，纈沙坦與雜質B的分離度為9.46，且各物質之間有較好的分離；空白輔料對有關物質測定無干擾，專屬性良好；強制降解試驗中，雜質可與主峰完全分離。結論該方法結果準確，重復性好，可靠性強，可用于測定纈沙坦氨氯地平片中的有關物質。

關鍵詞：纈沙坦氨氯地平；有關物質；高效液相色譜

纈沙坦氨氯地平片是由諾華公司研發，并于2006年12月獲得美國FDA批準用于治療原發性高血壓，用于單藥治療不能充分控制血壓的患者。由于該藥療效確切，國內開展了大量的該復方制劑仿制藥的研發工作[1-3]，而有關物質的完整研究資料是申報該復方制劑的重要組成部分，建立有關物質的質量標準以控制有關物質含量。參照纈沙坦氨氯地平片進口標準“有關物質”項下檢測的雜質及購得的雜質對照品，將纈沙坦雜質B(結構式見圖1)和氨氯地平雜質D(結構式見圖2)列入標準考察。本試驗采用高效液相色譜法梯度洗脫方式，建立了快速、準確、分離度高的含量測定方法，從而為完善纈沙坦氨氯地平片的質量標準提供了依據。

圖1　纈沙坦雜質B結構示意圖

圖2　氨氯地平雜質D結構示意圖

1儀器與試藥

Agilent1220液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FA2004N電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；苯磺酸氨氯地平(中國藥品生物制品檢定所，批號：100374-200903)；纈沙坦(中國藥品生物制品檢定所，批號：100651-200902)；氨氯地平雜質D(Kony Pharma，批號：20090901)；纈沙坦異構體(Kony Pharma，批號：20080801)；乙腈為色譜純; 水為二次去離子水；其余試劑為分析純。

2方法與結果[4-10]

2.1色譜條件與系統適用性試驗采用Agilent,Eclipse plus色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B；檢測波長為237 nm；柱溫為30℃；進樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1，按表1進行線性梯度洗脫。

表1　線性梯度洗脫

精密量取氨氯地平雜質D對照品溶液和纈沙坦雜質B對照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。精密量取系統適應性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表2。結果顯示，氨氯地平及雜質D和纈沙坦及雜質B的理論塔板數均大于10 000，氨氯地平與雜質D的分離度及纈沙坦與雜質B的分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL量瓶中，加流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲使溶解，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

表2　有關物質系統適用性試驗結果

注：分離度1為氨氯地平與雜質D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質B的分離度。

2.2.2對照溶液精密量取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加流動相A-流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。

2.2.3氨氯地平雜質D對照品溶液取氨氯地平雜質D對照品適量，精密稱定，加流動相A-流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質D 0.8 mg的對照品溶液。

2.2.4纈沙坦雜質B對照品溶液取纈沙坦雜質B對照品適量，精密稱定，加流動相A-流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質B 0.8 mg的對照品溶液。

2.3雜質歸屬

2.3.1氨氯地平雜質D對照品溶液取氨氯地平雜質D對照品適量，精密稱定，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質D 0.8 mg的對照品溶液。

2.3.2纈沙坦雜質B對照品溶液取纈沙坦雜質B對照品適量，精密稱定，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質B 0.8 mg的對照品溶液。

2.3.3苯磺酸溶液精密量取液體苯磺酸1 mL，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋至100 mL。

2.3.4氨氯地平原料溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平原料14 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為氨氯地平原料溶液。

2.3.5纈沙坦原料溶液精密稱取纈沙坦原料16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦原料溶液。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表3。苯磺酸的保留時間為2.092 min，氨氯地平雜質D保留時間為7.231 min，纈沙坦雜質B保留時間為13.937 min，未知雜質分別為8.876、9.097、14.817 min。

表3　雜質歸屬結果

注：“—”為未檢出。

2.4系統適用性試驗

2.4.1纈沙坦氨氯地平對照品溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平對照品14 mg和纈沙坦對照品16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦氨氯地平對照品溶液。

2.4.2系統適用性溶液精密量取氨氯地平雜質D對照品溶液和纈沙坦雜質B對照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。精密量取系統適應性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表4。

2.5雜質相對保留時間及校正因子因有關物質測定為梯度洗脫，流動相相對固定，未考察不同流動相比例下各雜質的對保留時間，重點考察兩個廠家的色譜柱測定雜質的保留時間，并計算校正因子。

色譜柱1：Lichrospher C18(150 mm×64.6 mm,5 μm)；色譜柱2：Agilent C18(150 mm×64.6 mm, 5 μm)。

精密量取系統適用性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見表5。

表4　有關物質系統適用性試驗結果

注：分離度1為氨氯地平與雜質D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質B的分離度。

表5　雜質保留時間考察試驗結果

注：RRT(雜質相對保留時間)均為相對于氨氯地平峰的保留時間。

由上述試驗結果可知，雜質D相對于氨氯地平的保留時間為0.570～0.647 min，平均值為0.61 min，雜質B相對于氨氯地平的保留時間為1.233～1.325 min，平均值為1.28 min，因此擬定雜質D相對于氨氯地平的保留時間為0.61 min，雜質B相對于氨氯地平的保留時間為1.28 min。

試驗測得雜質D的校正因子為2.03，雜質B的校正因子為1.01～1.02，參考纈沙坦氨氯地平片進口標準，確定雜質D的校正因子為2.0，雜質B及其他雜質的校正因子為1.0。

2.6空白輔料干擾試驗取空白輔料樣品0.083 0 g，置50 mL量瓶中，加流動相A—流動相B(1∶1)溶解并稀釋至刻度，作為空白輔料溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果可知，空白輔料溶液不出峰，不干擾本品有關物質的測定。

2.7耐用性試驗為了考察色譜條件微小的變動能否通過設計的系統適用性試驗，確保方法的有效性，故采用改變下列條件考察本方法的耐用性。結果見表6，7。

原色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Licrospher C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調節pH值至2.8)為流動相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動相B，進行梯度洗脫；檢測波長：237 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

表6　氨氯地平耐用性試驗結果

表7　纈沙坦耐用性試驗結果

結論：流動相pH、流速及柱溫的變化對氨氯地平和纈沙坦的有關物質檢查無影響，雜質峰的數量沒有增加。表明本方法系統耐用性良好，故確定色譜條件為：流動相A∶磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調節pH至2.8)，流動相B：甲醇—乙腈(70∶30)，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫30℃。

2.8檢測限取本品供試品溶液，稀釋進樣至信噪比為3∶1，作為檢測限，氨氯地平檢測限為0.695ng，纈沙坦檢測限為0.775 ng，能滿足有關物質檢查的要求。

2.9溶液放置穩定性試驗取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖,結果顯示供試品溶液中氨氯地平和纈沙坦在12 h內基本穩定，RSD=1.36%。

2.10強制降解試驗

2.10.1未破壞取本品細粉適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加入流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續濾液作為破壞前溶液。

2.10.2酸破壞試驗取本品細粉適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加1 mol·L-1鹽酸溶液3 mL，置80℃水浴中加熱約30 min，放冷至室溫，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調至中性，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續濾液作為酸破壞溶液。

2.10.3堿破壞試驗操作步驟同酸破壞試驗，僅將鹽酸換位氫氧化鈉，得堿破壞溶液。

2.10.4氧化破壞試驗取本品細粉適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加30%的雙氧水溶液5 mL，靜置2 h，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續濾液作為氧化破壞溶液。

2.10.5高溫破壞試驗取本品細粉適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加流動相A—流動相B(1∶1)5 mL，置100℃水浴中加熱約2 h，放冷至室溫，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續濾液作為高溫破壞溶液。

2.10.6光照破壞試驗取本品細粉適量(約相當于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，置照度為(4 500±500)Lx的光照箱中48 h，加入流動相A—流動相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動相A—流動相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續濾液作為光照破壞溶液。

另取空白輔料、纈沙坦和氨氯地平的混合原料(按處方比例混合)、被仿制品細粉，同法操作。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

圖3　強制降解試驗色譜圖

圖3可見本品在酸、堿、高溫、氧化、光照條件下均不穩定，原料帶入雜質B，酸破壞降解產物主要有雜質D和相對氨氯地平峰保留時間約為0.24的未知雜質，堿破壞降解產物主要有雜質B、D和相對氨氯地平峰保留時間在0.35～0.42 min之間的未知雜質，氧化破壞降解產物主要有雜質D，高溫破壞降解產物主要有雜質B、D和相對氨氯地平峰保留時間約為0.24 min的未知雜質，光照破壞降解產物主要有雜質B、D和一些未知雜質。自制樣品降解產物個數和變化趨勢與上市樣品基本一致。

3討論

《英國藥典》(2009年版)中纈沙坦氨氯地平片有關物質中，纈沙坦與氨氯地平分別記錄了4種有關物質，查閱相關文獻[11-13]，均將氨氯地平雜質D和纈沙坦雜質B列入考察標準中。

本試驗分別從系統適應性、專屬性以及強制降解試驗方面分別考察了HPLC測定纈沙坦氨氯地平片有關物質的方法，結果顯示的目標色譜峰與有關物質分離效果良好，本HPLC法測定有關物質方法簡便、快捷、可靠，可用于纈沙坦氨氯地平復方片質量標準中有關物質的檢測。

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Research on related substance of valsartan Amlodipine

ZHOU Zhi-yong1，HUANG He-fei2，ZHANG Ye2

(1.CollegeofMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity; 2.DepartmentofPharmacy,SecondCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:Objective Aimed to establish an analytical method for related substances of valsartan Amlodipine tablets. Methods The sample was determined by HPLC (Agilent1220). The analysis was performed on Eclipse plus C(18 )column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the detection wavelength at 237 nm. Using phosphate buffer (10 ml triethylamine volumetric to 1 000 mL,adjusted to pH 2.8 with phosphoric acid) as mobile phase A, methanol - acetonitrile (70∶30) as mobile phase B, and linear gradient, mobile phase was initiated at a flow rate of 1.0 mL·min(-1).Results The resolution of amlodipine and impuritie D was 14.44;the resolution of amlodipine and impuritie B was 9.46, and there was good resolution between each substance. Conclusions This method is accurate, reproducible and reliable, which can be used to determine the related substances of valsartan Amlodipine tablets.

Key words:valsartan amlodipine;related substance;HPLC

(收稿日期：2015-10-20，修回日期：2016-02-26)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.010