還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

張?bào)蕖堣F栓　韓利

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科　河南 鄭州　450014)

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還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞的保護(hù)作用

張?bào)迯堣F栓韓利

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科河南 鄭州450014)

【摘要】目的探索還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。方法將40只豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘組、還原型谷胱甘肽組和地塞米松組，每組10只，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中的干擾素-r(INF-r)水平及肺組織總抗氧化能力(T-AOC)，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色法(TUNEL染色)檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞凋亡情況，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定肺組織B淋巴細(xì)胞/白血病-2信使核糖核酸(Bcl-2 mRNA)的表達(dá)。結(jié)果與哮喘組相比，還原型谷胱甘肽組支氣管肺泡灌洗液中干擾素-r(INF-r)顯著升高(P<0.05)，與地塞米松組相似(P>0.05)，氣道上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)顯著降低(P<0.05)，肺組織T-AOC測(cè)定及Bcl-2 mRNA的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】哮喘；還原型谷胱甘肽；凋亡

支氣管哮喘是較為常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，發(fā)病率近年有上升趨勢(shì)，不僅對(duì)個(gè)人身體造成嚴(yán)重影響，也為社會(huì)增加負(fù)擔(dān)。因其本質(zhì)是氣道慢性炎癥，Que等[1]通過對(duì)哮喘患者行肺部活檢發(fā)現(xiàn)其呼吸道上皮細(xì)胞凋亡增加，同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)也證明，在強(qiáng)氧化劑的作用下哮喘患者的呼吸道上皮細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。還原型谷胱甘肽作為一種重要的在細(xì)胞內(nèi)外均有保護(hù)作用的抗氧化劑，本文研究其對(duì)哮喘的氣道上皮細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用，可為臨床治療提供新的方向。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康豚鼠40只，雌雄各20只，購于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(450±25)g，于清潔通風(fēng)環(huán)境中分籠喂養(yǎng)。將40只豚鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松組和還原型谷胱甘肽組，每組10只。

1.2主要試劑與儀器雞卵白蛋白(美國Sigma公司)，還原型谷胱甘肽(阿拓莫蘭)注射液(重慶藥友制藥責(zé)任有限公司)，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(POD)(德國Boehringer Mannheim公司)，圖像記錄分析系統(tǒng)(D-14)(大連競邁生物科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物模型準(zhǔn)備采用雞卵白蛋白致敏和激發(fā)建立豚鼠哮喘模型，第1天腹腔內(nèi)注射2%雞卵白蛋白氫氧化鋁凝膠2 ml致敏豚鼠，第8天重復(fù)注射加強(qiáng)致敏，第21天吸入2%雞卵白蛋白生理鹽水激發(fā)哮喘發(fā)作，霧化吸入10 min前腹腔注射生理鹽水2 ml，共7 d，以豚鼠腹肌出現(xiàn)明顯收縮、嗆水、喘鳴等呼吸道阻塞癥狀為造模成功[2]。

1.3.2干預(yù)正常對(duì)照組：第1天腹腔內(nèi)注射生理鹽水2 ml，第8天重復(fù)注射，第21天吸入生理鹽水10 ml/10 min，霧化吸入10 min前腹腔注射生理鹽水2 ml，共7 d。地塞米松組：誘發(fā)前給予2 ml地塞米松2 mg/(kg·d)劑量配比液腹腔注射，共7 d。還原型谷胱甘肽組：誘發(fā)前給予2 ml還原型谷胱甘肽0.1 g/(kg·d)劑量配比液腹腔注射，共7 d。

1.3.3標(biāo)本留取與檢測(cè)全部豚鼠于末次激發(fā)后24 h，腹腔注射10%烏拉坦1.5 ml麻醉，以開胸后心臟采血的方法處死，用聚乙烯導(dǎo)管插入右肺總支氣管，37.0 ℃生理鹽水3 ml/次緩慢灌洗右肺，反復(fù)3次，收集回收液離心，取上清液進(jìn)行ELISA法測(cè)定INF-r，再沿左支氣管走形方向取肺組織，分4等份，分別采用ELISA法測(cè)定T-AOC，行TUNEL染色計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，做電鏡切片及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Bcl-2 mRNA。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動(dòng)物性狀變化正常對(duì)照組豚鼠肥大強(qiáng)壯，精神良好，飲食正常，活潑愛動(dòng)，口唇紅潤，皮毛有光澤且不易脫落。哮喘組豚鼠發(fā)育不良，精神萎靡，飲食及活動(dòng)量少，口唇發(fā)紺，皮毛枯槁且有脫毛。還原型谷胱甘肽組和地塞米松組性狀較哮喘組輕，雖存在一定程度的精神萎靡，飲食及活動(dòng)量少，但無口唇發(fā)紺及脫毛現(xiàn)象。

2.2支氣管肺泡灌洗液INF-r檢查結(jié)果正常對(duì)照組INF-r明顯高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組INF-r明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而還原型谷胱甘肽組及地塞米松組INF-r差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　支氣管肺泡灌洗液INF-r檢測(cè)結(jié)果

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.001；與哮喘組比較，bP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，cP>0.05。

2.3肺組織T-AOC的測(cè)定正常對(duì)照組T-AOC高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組T-AOC明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，還原型谷胱甘肽組T-AOC高于地塞米松組(P<0.05)。見表2。

2.4氣道上皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè)通過TUNEL染色對(duì)氣道上皮凋亡的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，各組豚鼠氣道上皮細(xì)胞均存在不同程度的凋亡現(xiàn)象。正常對(duì)照組氣道上皮凋亡明顯低于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組氣道上皮凋亡明顯高于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而氣道上皮凋亡在還原型谷胱甘肽組及地塞米松組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3及圖1。

表2　各組豚鼠肺組織T-AOC比較

注：與正常對(duì)照組比較，dP<0.001；與哮喘組比較，eP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，fP<0.001。

表3　各組豚鼠氣道上皮凋亡指數(shù)比較±s)

注：與正常對(duì)照組比較，gP<0.001；與哮喘組比較，hP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，iP>0.05。

A為正常對(duì)照組；B為哮喘組；C為地塞米松組；D為還原型谷胱甘肽組。

圖1各組氣道上皮細(xì)胞凋亡圖

2.5電鏡結(jié)果正常對(duì)照組氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，僅有少部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器完整。哮喘組支氣管上皮細(xì)胞重度腫脹，細(xì)胞膜消失，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容溢出，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。地塞米松組支氣管上皮細(xì)胞單層排列，部分細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴溶解、消失，空泡樣改變。還原型谷胱甘肽組支氣管上皮細(xì)胞單層排列，部分細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，部分線粒體呈腫脹狀態(tài)，另可見少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體及溶酶體等細(xì)胞器。見圖2。

E為正常對(duì)照組；F為哮喘組；G為地塞米松組；H為還原型谷胱甘肽組。

圖2各組支氣管上皮細(xì)胞電鏡圖

2.6各組豚鼠肺組織Bcl-2mRNA的表達(dá)正常對(duì)照組Bcl-2 mRNA的表達(dá)高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，還原型谷胱甘肽組Bcl-2 mRNA的表達(dá)高于地塞米松組(P<0.05)。見表4和圖3。

表4　各組豚鼠肺組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)

注：與正常對(duì)照組比較，jP<0.001；與哮喘組比較，kP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，lP<0.001。

圖3　各組豚鼠肺組織Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況

3討論

有研究顯示哮喘炎癥反應(yīng)使氧自由基產(chǎn)生增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，肺組織抗氧化能力下降，支氣管上皮凋亡增加，氣道上皮損傷[3-4]。那么，維持氧化-抗氧化平衡可能成為治療哮喘的新出發(fā)點(diǎn)[5]。還原型谷胱甘肽是一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中普遍存在的包括巰基的三肽(左旋谷氨酰半胱氨酸-甘氨酸)。它是一個(gè)重要的有保護(hù)作用、抗自由基和其它氧化劑作用的抗氧化劑，而且它還涉及免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)[6]。抗氧化劑還原型谷胱甘肽具有重要的肺抗氧化劑防御功能，尤其在保護(hù)上皮(基膜完整性)不受氧化/自由基(香煙/空氣微粒)介導(dǎo)的損傷和炎癥，它在保持氣道上皮細(xì)胞完整性，抵御肺部損傷與炎癥等方面起重要作用[7-8]。

正常情況下呼吸道上皮細(xì)胞數(shù)目保持相對(duì)穩(wěn)定，呼吸道上皮可發(fā)生較低水平的增殖，同時(shí)存在相應(yīng)的自發(fā)性凋亡，兩者受到凋亡-抗凋亡和增殖-抗增殖的精密調(diào)節(jié)，呼吸道上皮凋亡是哮喘的重要病理特征，也是哮喘不同于其他慢性呼吸道疾病呼吸道重塑的重要特征[9]。糖皮質(zhì)激素雖被證實(shí)在大多數(shù)情況下能很好地控制氣道炎癥，但對(duì)呼吸道重塑特別是呼吸道上皮細(xì)胞凋亡的作用仍存爭議[10]。細(xì)胞凋亡由多種基因控制，參與細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種，根據(jù)功能不同大致可分為3類。凋亡促進(jìn)基因：P53、WAF1、myc、Fas/FAS配體等；凋亡抑制基因：Bcl-2、IAP、Bak、EIB、Bax；雙向調(diào)節(jié)基因：C-myc、Bcl-X等。其中Bcl-2的研究最為詳細(xì)。Bcl-2是B淋巴細(xì)胞/白血病-2(B cell lympona/leukemia-2)基因的縮寫形式，它是第1個(gè)被確認(rèn)具有抑制凋亡作用的基因，主要分布在線粒體內(nèi)膜、細(xì)胞內(nèi)膜表面、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核膜等處，廣泛存在于上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞。目前認(rèn)為，Bcl-2主要通過以下機(jī)制抗凋亡[11-12]：直接抗氧化；抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質(zhì)；抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax、Bak的細(xì)胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶的激活；維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)。本研究通過以下幾方面證實(shí)了還原型谷胱甘肽對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用：一般性狀變化較輕；支氣管肺泡灌洗液中INF-r顯著升高；電鏡結(jié)果顯示支氣管上皮細(xì)胞、細(xì)胞器病理改變較輕；氣道上皮細(xì)胞凋亡程度較輕；Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)。這提示還原型谷胱甘肽可能通過清除氧自由基的功能影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的某些基因或者蛋白的表達(dá)，如還原型谷胱甘肽上調(diào)了Bcl-2 mRNA的表達(dá)，從而抑制氣道上皮細(xì)胞的凋亡。

哮喘研究中對(duì)Th1/Th2細(xì)胞失衡機(jī)制關(guān)注較多。作為Th1的代表因子，INF-r是評(píng)估哮喘病情的重要指標(biāo)。糖皮質(zhì)激素作為哮喘治療的一線用藥，其可通過提高INF-r改善Th1/Th2細(xì)胞失衡狀態(tài)，本研究結(jié)果與之相符合，但長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，相關(guān)副作用也逐漸被廣泛關(guān)注。哮喘組INF-r明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而還原型谷胱甘肽組及地塞米松組INF-r差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示還原型谷胱甘肽與糖皮質(zhì)激素在調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞失衡機(jī)制中有著相似的作用。本項(xiàng)研究為哮喘的治療帶來了新的思路，但其能否在臨床推廣，尚需進(jìn)一步研究。

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Protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma

Zhang Yun，Zhang Tieshuan，Han Li

(DepartmentofRespiratoryMedicine，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma. MethodsForty guinea pigs were randomly divided into 4 groups: control group, asthma group, reducing glutathione group and dexamethasone group, 10 guinea pigs in each group. INF-r level in bronchoalveolar lavage fluid was detected by enzyme linked immunosorbent assay. TUNEL was used to detect the level of epithelial cells and RT-PCR was used to determine the status of Bcl-2mRNA in lung tissue. ResultsCompared with asthma group, the INF-r levels in bronchoalveolar lavage fluid of reducing glutathione group were statistically higher(P<0.05), similar with that in the dexamethasone group(P>0.05).The levels of T-AOC and Bcl-2 mRNA in lung tissue of reducing glutathione group were significantly upper compared with asthma group(P<0.05). ConclusionReducing glutathione have the ability to protect airway epithelium in guinea pig models of asthma.

【Key words】asthma；reducing glutathione；apoptosis

(收稿日期：2015-09-25)

【中圖分類號(hào)】R 392.3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.04.005

通訊作者：張鐵栓，E-mail：huxizhangtieshuan@163.com。