柑橘CitSERK—LIKE基因原核表達載體的構建與表達

葛曉霞

摘要：用RT-PCR擴增伏令夏橙體細胞胚發生類受體蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）基因ORF區全長，克隆入載體，酶切后亞克隆入原核表達載體，并用SDS-PAGE觀察CitSERK-LIKE基因的原核表達情況。結果顯示，成功構建了pET-CitSERK1-like原核表達重組質粒，該重組質粒在大腸桿菌中可經IPTG誘導表達分子量約為69 ku的融合蛋白，與預測蛋白一致。

關鍵詞：柑橘；CitSERK1-like；表達載體；構建；原核表達

中圖分類號： S188；S666.01

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0022-03

植物體細胞胚胎發生作為植物細胞全能性的一種表達方式，是高等植物合子胚發育早期事件中基因表達調控研究的理想模型[1]。體細胞胚發生類受體蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase）是在體細胞胚發生過程中發揮重要作用的一類激酶，屬于LRR-RLK亞家族。Schmidt等首先從胡蘿卜懸浮培養的胚性細胞中分離出第1個SERK基因，并發現它只在胚性細胞內表達且只表達到體細胞胚的球形期[2]。在其他物種中，體細胞胚發生過程與SERK基因緊密地聯系在一起，相繼在多個物種中克隆并鑒定了SERK基因，如鴨茅[3]、苜蓿[4-5]、水稻[6]、小麥[7]、馬鈴薯[8]、柑橘[9-10]、仙客來[11]、菠蘿[12-13]等。

本研究在前期克隆獲得柑橘體細胞胚發生類受體蛋白激酶基因CitSERK1-like的基礎上[10]，構建了CitSERK1-like的原核表達載體，為今后大量表達、純化CitSERK1-like蛋白和開展相關的功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 pMD-CitSERK1-like克隆載體的獲得

根據GenBank登錄的CitSERK-like基因序列 （登錄號為FJ851422），設計正反向引物，FP：5′-ATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′；RP：5′-TCACCTTGGACCAGATAACTC-3′。PCR 反應在 PTC-200 Thermocycler 中進行。20 μL反應體系為：0.2 μmol/L dNTP，1.5 mmol/L MgCl2，1 U Ex Taq DNA 聚合酶 （TaKaRa，Japan） ，1×buffer，正反向引物各 0.4 μmol/L，50ng模板cDNA。擴增程序為：94℃變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，33個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物在1.8%瓊脂糖凝膠上分離后，用E.Z.N.ADNA 回收試劑盒 （Omega，USA） 回收備用。載體的連接參照TaKaRa公司的pMD18-T Vector試劑盒說明書進行，經PCR檢測、測序驗證pMD-CitSERK1-like重組質粒構建成功。

1.2 pET-CitSERK-like原核表達載體的構建

構建CitSERK1-like原核表達載體引物序列為：YHF：5′-CGGAATTCATGAAGACTAAGGTTTGGGCT-3′ （EcoRⅠ），YHR：5′-GCCTCGAGTCACCTTGGACCAGATAAC-3′ （XhoⅠ），以稀釋的質粒pMD-CitSERK1-like為模板進行PCR擴增：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物電泳檢測回收、測序，用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切質粒，回收酶切片段，與經EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-28a （+） 載體進行連接，獲得重組質粒pET-CitSERK1-like，構建流程參見圖1。經PCR檢測、酶切、測序驗證ORF正確后用于蛋白表達。

1.3 pET-CitSERK-like原核表達載體的誘導表達

將重組質粒pET-CitSERK1-like和空白載體pET-28a （+） 分別轉化表達菌株E. coli BL21，挑取陽性克隆，接種于3 mL LB液體培養基 （含卡那霉素），37 ℃振蕩培養過夜，按1 ∶100的比例接種于新鮮LB液體培養基中，于37 ℃振蕩培養至D600 nm約為0.6～1.0時，加IPTG 1.0 mmol/L分別誘導0、1、2、3、4、5、6、7 h。其間收集菌液，4 ℃、12 000 g離心1 min，棄上清液，沉淀用100 μL SDS凝膠加樣緩沖液 （Tris-HCl 50 mmol/L，pH值6.8；SDS 2%；二硫蘇糖醇100 mmol/L；溴酚藍0.1%；甘油10%） 重懸，混勻后沸水浴5 min，12 000 g 離心1 min，取20 μL上清液于12%的SDS-PAGE電泳檢測。樣品在濃縮膠中以40 V電壓電泳，當溴酚藍到達分離膠和濃縮膠界面時，將電壓調至80 V，直至溴酚藍接近凝膠邊緣時，停止電泳，取出凝膠。切除濃縮膠，將分離膠置于考馬斯亮藍R-250染色液中染色，脫色后進行觀察。

2 結果與分析

2.1 pMD-CitSERK1-like克隆載體的獲得

從伏令夏橙甘油誘導1個月的胚性愈傷中克隆SERK基因，隨機挑取多個克隆測序，獲得包含完整的SERK ORF cDNA序列的單克隆。序列分析結果表明，CitSERK1-like cDNA 序列長度為1 866 bp （圖2），編碼621個氨基酸，預測分子量均為69.125 ku。

2.2 pET-CitSERK-like原核表達載體構建

用分別帶有EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點的1對引物擴增CitSERK-like基因的編碼區全長，擴增產物在用EcoRⅠ、XhoⅠ酶切與純化后，連接到使用同樣2個酶酶切、純化過的pET-28a （+） 載體上，構建獲得原核表達載體pET-CitSERK1-like。含該表達載體的克隆經PCR檢測、酶切驗證，圖3結果表明，PCR擴增片段、酶切片段與CitSERK-like基因編碼區片段大小相同。測序確認讀碼框正確后，轉化至大腸桿菌菌株BL21中誘導蛋白表達。

2.3 CitSERK-like基因的原核表達與SDS-PAGE分析

重組質粒pET-CitSERK1-like轉入E.coli BL21后，用IPTG誘導其表達。結果表明，pET-CitSERK1-like能夠表達1條約69 ku的特異蛋白 （箭頭所示），與預測的含有六聯組氨酸標簽 （6×His Tag） 的融合蛋白的分子量大小吻合，而空白對照pET-28a （+） 質粒表達的蛋白中沒有此帶（圖4）。

3 討論

在高等植物中，體細胞胚發生為基因工程、細胞工程等生物技術改良品種提供了良好的試驗體系[14]。體細胞胚發生類受體蛋白激酶在植物生命活動中是極其重要的一類激酶，目前，擬南芥[15]、水稻[6]、萵苣[16]等多個物種中相繼獲得轉基因植株，證明該基因在植物體細胞胚發生過程中發揮重要作用。同時，該基因在參與植物生命活動，如植物發育[4，17]、激素信號轉導[18-19]和抗逆反應[6]等方面具有非常重要的生理功能。雖然在不同物種中已分離鑒定出眾多體細胞胚發生類受體蛋白激酶，但目前對其信號轉導和配體識別等方面了解還并不清晰，要闡明體細胞胚類受體蛋白激酶在體胚發生過程中的作用，還需從蛋白質水平進一步研究。本研究構建了柑橘CitSERK-like基因的原核表達載體，經IPTG誘導，在大腸桿菌中成功表達了含His-tag的融合蛋白，為進一步進行蛋白純化以及驗證CitSERK1-like蛋白功能創造了條件。

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