3.5mg/L水楊酸誘導斜生柵藻積累蝦青素的分子機理

凌善鋒+蔡福歡+劉彥文+朱勇+韓梁+程淼

摘要：在自然條件下，向對數生長期的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）培養液中加入3.5 mg/L的水楊酸溶液，進行脅迫培養以誘導藻類細胞內蝦青素的合成與積累。在培養過程中，每隔3 d對藻液取樣制片，然后用顯微鏡觀察其生長狀況及細胞形態變化。結果發現：經3.5 mg/L水楊酸誘導的藻的形態發生了明顯變化，該水楊酸溶液對于斜生柵藻細胞來說是一種逆境脅迫因子，藻細胞內通過積累高達1.123 mg/g的蝦青素來形成一種自我保護機制。八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）基因表達水平上調是藻細胞合成蝦青素的主要調控機制。隨著培養時間增加，藻細胞生物量呈時間依賴性增加（除15 d外），最高達2.08×106個/mL。

關鍵詞：水楊酸；斜生柵藻；形態；生物量；蝦青素；分子機制

中圖分類號： S917

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0287-04

蝦青素是類胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于酮式類胡蘿卜素，具有增強免疫功能等生理作用，是一種極具應用潛力的次生代謝物質，在食品、飼料、化妝品、醫藥等領域有著廣闊的應用前景[1]。目前蝦青素主要用于水產養殖的色素添加劑，售價高達1 200萬元/t，估計全球每年需求量超過20億美元。天然蝦青素的主要生產來源是雨生紅球藻提取以及從紅法夫酵母菌發酵液中提取，但這些蝦青素的產量遠不能滿足市場需求。斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是一種廣泛分布于溫暖地區的池塘、溝渠及河流中的淡水單細胞綠藻，其生命力強、繁殖快，對環境條件變化反應敏感，是培養蝦青素的另一種理想來源[2]。

藻體內蝦青素的生物合成過程主要是由一些關鍵酶催化完成的，一般有異戊二烯焦磷酸異構酶（IPI）、八氫番茄紅素合成酶（PSY）、番茄紅素-β-環化酶（LYC）、β-胡蘿卜素羥化酶（crtR-b）、八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）、β-胡蘿卜素酮化酶（BKT）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）等[3-5]。例如，PDS和ZDS催化無色的八氫番茄紅素轉化成紅色的番茄紅素，crtO催化β-胡蘿卜素形成蝦青素的部分氧化反應。但是，缺乏藻體內蝦青素合成的分子調控機理的研究使得蝦青素大規模商業應用受到限制。為了更好地理解蝦青素生物合成的酶基因調控機理，近年來，學者們運用熒光定量PCR來研究所測定的類胡蘿卜素基因表達和蝦青素的積累之間的關系，Gao等從分子水平分析得到，25 mg/L 水楊酸（SA）誘導條件下雨生紅球藻中蝦青素的生物合成主要是通過ipi-1、ipi-2、psy、crtR-B、bkt、crtO基因在翻譯水平和lyc在翻譯后水平的上調實現的，pds同時在翻譯和翻譯后2個水平的上調實現。而且，ipi、crtO、bkt基因的5′上游側翼序列中可能包含水楊酸（SA）調控相關的順式反應元件TCA-element（水楊酸反應元件），這意味著水楊酸作為蝦青素合成的有效調控子刺激形成蝦青素[6]。茉莉酮酸甲酯和赤霉素誘導開啟了3種bkt基因的表達，并且學者們在該基因的5'側翼序列中識別出了順式作用元件，因此形成了蝦青素生物合成調控網絡的分子信號[7]。在氮缺乏和強光等脅迫條件下，雨生紅球藻體中pds基因表達水平明顯上調[8]。最近的研究表明，在0.17 mol/L鹽誘導10 d后，雨生紅球藻QLD株產生17.7 mg/g干質量蝦青素，其主要原因是ipi-1、ipi-2、psy、lyc、bkt2、crtR-B、crtO共7個蝦青素的生物合成基因上調，其中前5個酶基因上調更明顯，即：由酶IPI催化丙酮酸鹽形成二甲基丙烯焦磷酸，由PSY催化牻牛兒焦磷酸合成四十碳的八氫番茄紅素，由LYC催化番茄紅素環化形成β-胡蘿卜素，由BKT催化β-胡蘿卜素形成蝦青素的部分氧化反應的酶促反應能力均得到明顯加強[9]。

利用斜生柵藻生產天然蝦青素具有誘人的探索前景；但是至今還未見用水楊酸誘導斜生柵藻生產蝦青素的嘗試。本試驗是首次試圖利用水楊酸脅迫斜生柵藻培養蝦青素，利用熒光定量PCR分析蝦青素合成關鍵酶基因的新穎表達水平譜，并且得出與之緊密相關的蝦青素產量，本研究為水楊酸介導的信號網絡和蝦青素生物合成通路之間的關系提供證據，而且揭示出水楊酸在類胡蘿卜素形成中起到的新多功能作用，將為水楊酸在蝦青素產業化中的大規模應用提供基礎實踐知識。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水楊酸，斜生柵藻藻種，標準培養液，攝影顯微鏡，臺式高速冷凍離心機，紫外分光光度計，GYB30-6A高壓均質機（上海東華高壓均質機廠），超聲細胞破碎儀等。

1.2 斜生柵藻的培養

斜生柵藻株購自中國科學院武漢水生生物研究所，每個250 mL錐形瓶中加入培養基150 mL，以及稀釋的接種藻液30 mL。自然光照，強度為1 000～1 500 lx，35.5 ℃靜止培養，直至培養到生長期，然后用3.5 mg/L水楊酸進行脅迫培養。

1.3 3.5 mg/L水楊酸對斜生柵藻生物量的影響試驗

每500 mL瓶中裝200 mL藻液，加入水楊酸使終濃度達到3.5 mg/L進行培養，共培養18 d，每隔3 d考察3.5 mg/L水楊酸對斜生柵藻生物量的影響，以不加水楊酸的相應處理作為對照（表1），每個培養時間3次重復。

由表1可知，18 d內，各培養時間的藻細胞生物量均高于對照，說明3.5 mg/L水楊酸能夠促進斜生柵藻細胞生物量的增加。且隨著培養時間增加，藻細胞生物量呈時間依賴性增加（除15 d外），培養15 d時藻細胞生物量最大，是對照的231倍，但差異不顯著（P>0.05）。該研究結果對于蝦青素生產具有極其重要的意義。

1.4 顯微觀察

水楊酸脅迫培養后，每隔3 d取少量處理的藻細胞在光學顯微鏡下觀察1次（按18 d計）并拍照，以不加水楊酸的相應處理作為對照，觀察藻細胞的形態、顏色變化及細胞聚集情況等。

1.5 蝦青素提取、含量測定

利用新型的高壓均質破壁和蝦頭殼內源酶輔助提取蝦青素相結合的方法提取蝦青素，具體如下：藻種預處理、高壓均質按照陳興才等的方法[10]并進行了優化，GYB30-6A高壓均質機進行高壓均質破壁的條件為：28 ℃，42 MPa，循環3次；蝦頭中的內源酶豐富，有活性很高的水解酶系，能有效地解離出蝦青素，利用姜淼等的方法[11]獲得內源酶粗酶，51 ℃、pH值4.2條件下酶解2 h進行輔助提取，提取后采用高政權等的方法[3]測定蝦青素含量，共3次重復。

1.6 熒光定量PCR分析

按照Gao等的方法[9]并作改進，具體如下：mRNA用SVRNA抽提試劑盒（Promega，USA）按照說明書進行提取，RNA的濃度用NanoDrop@ND-1000 （Nan oDrop，USA ）測定，cDNA在20 μL體系中用SuperScript Ⅲ第一鏈合成試劑盒進行合成。用作擴增特異基因 （蝦青素生物合成路線中的酶）的引物根據NCBI數據庫或庫中的同源序列用Primer Premier 5.0合成，如表2所示。qRT-PCR產物用自動移液器移到384孔的板上，在ABI StepOne Plus System （Applied Biosystems，USA）中用SYBR熒光綠進行定量，act作為內標基因。每個PCR反應包括5 μL SYBR熒光綠、1 μL的引物復合物（包括正向和反向，濃度為5 μmol/L）、4 μL cDNA、2 μL PCR反應緩沖液（含Mg2+）、0.3 μL Taq DNA聚合酶（Promega公司）、0.3 μL dNTP（濃度為15 mmol/L）、超純水。qRT-PCR的擴增條件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，退火30 s（退火溫度如表2），72 ℃ 15 s，42個循環。同一個樣品同一個基因的qRT-PCR試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 顯微觀察

顯微觀察得到： 對照組（不加水楊酸）細胞兩端尖細變橢，并且以4個或2個為群體的形式存在（圖1-1）。3.5 mg/L水楊酸培養3 d后，藻細胞形態變化較明顯（圖1-2）。3.5 mg/L處理組培養6 d后，觀察細胞形態，細胞變大變圓甚至出現不規則形狀，并有微紅色出現（圖1-3），說明蝦青素開始逐漸在斜生柵藻細胞中積累。培養9 d后，原本的青綠色細胞逐漸變淡，最后轉為微紅色，同時藻類數量明顯增多，細胞的形態也由兩端尖細逐漸膨脹、變圓甚至有不規則形態（圖1-4）；而且，以4個細胞的群體形式存在的細胞群體解散，分為單個細胞。3.5 mg/L水楊酸培養12 d后，培養液中藻細胞內有明顯的紅色，推測蝦青素積累在增加（圖1-5）。培養15 d后，細胞繼續脹大變橢、變紅，一些細胞開始聚堆，而且細胞內紅色明顯加深（圖1-6）。培養18 d后，細胞中蝦青素的積累少量增加，仍然是3.5 mg/L培養液中藻細胞內紅色積累最多，但細胞出現了自溶現象（圖1-7）。

2.2 蝦青素含量測定

在3.5 mg/L 水楊酸脅迫培養組，隨著藻細胞培養時間的延長（除了15 d），蝦青素的積累量在逐漸增加。方差分析表明，12、15、18 d斜生柵藻體內蝦青素含量與對照相比有顯著差異（P<0.05）（圖2）。

2.3 熒光定量PCR分析

與蝦青素含量相對應，熒光定量PCR分析表明：15、18 d斜生柵藻體內蝦青素合成基因pds和crtO的表達水平與對照相比有顯著差異（P<0.05），12 d后crtO和18 d后ipi基因表達水平與對照相比都有顯著差異（P<0.05）（圖3）。圖4分析表明：bkt和psy基因表達水平隨著水楊酸處理呈現時間依賴性地增加。

3 結論與討論

近些年來，蝦青素一直是國際學術界的研究熱點之一。學者們從雨生紅球藻、甲殼類等生物中提取蝦青素已經取得一些較好的研究成果[4-5]。自從2008年Qin等發現斜生柵藻能在逆境脅迫條件下迅速合成和積累蝦青素以來[2]，斜生柵藻可能就是下一個天然蝦青素產業化的熱點藻類。水楊酸作為一種新的植物內源激素，它不僅能調節植物的一些生長發育過程，而且是一種能夠激活植物一系列防御防衛反應的重要內源信號分子，藻體內可能存在蝦青素合成基因調控相關的水楊酸反應元件[3]。學者們研究了水楊酸對雨生紅球藻抗氧化系統的影響，發現500 μmol/L水楊酸使受光線脅迫的雨生紅球藻體內的超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶活性分別增加4.5和15.5倍[12]，5.0 mg/L水楊酸能明顯促進雨生紅球藻積累蝦青素，一方面加快蝦青積累進程，另一方面蝦青素產量顯著提高[3]。近年來，對雨生紅球藻中蝦青素合成關鍵酶基因的轉錄調控機制進行了研究，結果表明，在營養脅迫、光線脅迫等逆境條件下，通過運用熒光定量PCR等技術得出雨生紅球藻體內控制蝦青素合成的多個關鍵酶基因如β-胡蘿卜素酮基化酶、β-胡蘿卜素水解酶、番茄紅素-β-環化酶等明顯上調[8，13-14]。一定質量濃度的水楊酸作為一種誘導因子能促進雨生紅球藻積累蝦青素，水楊酸構筑了蝦青素生物合成調控網絡的分子信號。從分子水平分析得到，水楊酸誘導了8個類胡蘿卜素基因轉錄水平的表達，其中β-胡蘿卜素酮基化酶基因和β-胡蘿卜素羥化酶基因表達水平的上調是水楊酸壓力脅迫下雨生紅球藻大量積累蝦青素的原因之一[6]。在本研究中，八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）和β-胡蘿卜素加氧酶（crtO）的5′上游側翼序列中可能包含水楊酸調控相關的順式反應元件即水楊酸反應元件，水楊酸對斜生柵藻中蝦青素的積累具有一定影響，推測3.5 mg/L的水楊酸的加入會誘導開啟這些作用元件，誘導這2個非關鍵限速酶基因大量表達，從而明顯增加了藻細胞蝦青素的積累量，這也是它積累蝦青素比雨生紅球藻少的原因之一。

綜合上述試驗結果，分析得出如下3點結論：（1）在3.5 mg/L 水楊酸脅迫培養下，斜生柵藻的細胞形態出現明顯的變化；（2）用3.5 mg/L的水楊酸誘導18 d后斜生柵藻細胞脹大變橢圓且顏色呈紅褐色，此時蝦青素積累最快、最多、最佳；（3）3.5 mg/L的水楊酸溶液對于斜生柵藻細胞來說是一種逆境脅迫因子，藻細胞內積累高達1.123 mg/g的蝦青素來形成一種自我保護機制。

在產業化實踐中，除了對產蝦青素的斜生柵藻藻種進行培育[15]外，可以考慮在誘導初期添加3.5 mg/L的水楊酸溶液來提高斜生柵藻的飼料用價值。

致謝：本論文在美國費城完成，感謝美國農業部 （USDA）東部研究中心（ERRC）John Nghiem研究員的指導和幫助。

參考文獻：

[1]凌善鋒. 天然蝦青素產業的發展趨勢分析[J]. 生物學通報，2014，49（1）：6-7.

[2]Qin S，Liu G X，Hu Z Y. The accumulation and metabolism of astaxanthin in Scenedesmus obliquus（Chlorophyceae）[J]. Process Biochemistry，2008，43： 795-802.

[3]高政權，孟春曉，刁英英.施用水楊酸對雨生紅球藻中蝦青素積累的影響[J]. 水產科學，2007，26（7）：377-380.

[4]Sanchez-Camargo A P，Meireles M，Ferreira A L，et al. Extraction of ω-3 fatty acids and astaxanthin from Brazilian redspotted shrimp waste using supercritical CO2 ethanol mixtures[J]. The Journal of Supercritical Fluids，2012，61（1）：71-77.

[5]凌善鋒.雨生紅球藻培養基和誘導條件優化[J]. 江蘇農業科學，2013，41（11）：266-267.

[6]Gao Z Q，Meng C X，Zhang X W，et al. Induction of salicylic acid （SA） on transcriptional expression of eight carotenoid genes and astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis[J]. Enzyme and Microbial Technology，2012，51（4）： 225-230.

[7]Lu Y D，Jiang P，Liu S F，et al. Methyl jasmonate- or gibberellins A3-induced astaxanthin accumulation is associated with up-regulation of transcription of beta-carotene ketolase genes （bkts） in microalga Haematococcus pluvialis[J]. Bioresource Technology，2010，101（16）： 6468-6474.

[8]Vidhyavathi R，Venkatachalam L，Sarada R，et al. Regulation of carotenoid biosynthetic genes expression and carotenoid accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis under nutrient stress conditions[J]. Journal of Experimental Botany，2008，59（6）： 1409-1418.

[9]Gao Z Q，Meng C X，Chen Y C，et al. Comparison of astaxanthin accumulation and biosynthesis gene expression of three Haematococcus pluvialis strains upon salinity stress[J]. Journal of Applied Phycology，2015，27（5）：1853-1860.

[10]陳興才，歐陽琴，黃亞治. 雨生紅球藻物理破壁法提取蝦青素研究[J]. 中國食品學報，2007，7（2）：48-52.

[11]姜 淼，楊賢慶，李來好，等. 內源酶輔助提取蝦殼蝦青素的研究[J]. 南方水產科學，2011，7（2）：55-60.

[12]Raman V，Ravi S. Effect of salicylic acid and methyl jasmonate on antioxidant systems of Haematococcus pluvialis[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2011，33（3）：1043-1049.

[13]Jin E，Lee C G，Polle J E. Secondary carotenoid accumulation in Haematococcus （Chlorophyceae）： Biosynthesis，regulation，and biotechnology[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2006，16（6）： 821-831.

[14]Huang Jun Chao，Chen Feng，Sandmann G. Stress-related differential expression of multiple beta-carotene ketolase genes in the unicellular green alga Haematococcus pluvialis[J]. Journal of Biotechnology，2006，122（2）： 176-185.

[15]凌善鋒. 產蝦青素的斜生柵藻藻種的培育[J]. 湖北農業科學，2014，53（2）：283-285.李 輝，果雙雙，施振旦. 重組豬抑制素蛋白凍干保護劑的篩選[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：291-293.