ALEX1基因過表達慢病毒載體的構建和鑒定①

高　月　鄧小芳　雷繼魁

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶400700)

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ALEX1基因過表達慢病毒載體的構建和鑒定①

高月鄧小芳雷繼魁

(重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院檢驗科，重慶400700)

[摘要]目的：探討構建Arm重復蛋白1(ALEX1)基因過表達慢病毒表達載體，感染乳腺癌細胞系SK-BR3后觀察ALEX1的表達，為研究ALEX1在乳腺癌中的作用及機制奠定基礎。方法：利用DNA重組技術將ALEX1基因插入到慢病毒穿梭質粒LV5中，獲得重組慢病毒質粒V-ALEX1，經(jīng)酶切鑒定及DNA測序鑒定后，用 Lipofectamine 2000將重組質粒和慢病毒包裝質粒系統(tǒng)(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)轉染293T細胞中包裝成重組慢病毒顆粒，經(jīng)流式細胞術測定重組慢病毒滴度。將成功包裝的ALEX1過表達慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細胞(MOI為10)48～72 h，Real-time PCR和Western blot法分析ALEX1表達情況。結果：酶切鑒定結果顯示：產(chǎn)生約1 500 bp的片段，片段大小與ALEX1基因cDNA大小一致。DNA測序比對說明測序結果與預期ALEX1基因序列完全一致，證實ALEX1基因正確插入載體中，成功構建ALEX1基因過表達載體。經(jīng)293T細胞包裝后，成功獲得病毒滴度為4.25×108 TU/ml的重組慢病毒LV5-ALEX1。Real-time PCR和western blot結果顯示：與感染LV5-NC的SK-BR3細胞相比，LV5-ALEX1感染可明顯增加ALEX1 mRNA及蛋白的表達水平。結論：成功構建ALEX1基因過表達慢病毒載體，ALEX1基因過表達慢病毒能夠感染乳腺癌SK-BR3細胞，可使外源基因獲得穩(wěn)定過表達。

[關鍵詞]ALEX1；慢病毒；構建；鑒定

Arm家族蛋白是指含有Armadillo repeat結構的一類蛋白。Armadillo repeat結構是首次在果蠅的極性基因中發(fā)現(xiàn)，該基因在果蠅的早期細胞極性形成、維持上皮組織的完整性和早期胚胎形成過程中具有重要作用[1]。ALEX1 (Arm proteins lost in epithelial cancers on chromosome X1)蛋白是Arm重復蛋白家族成員之一，被認為是一種抑癌基因[2]。其在人類多種腫瘤中如肺癌、前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌中表達降低或缺失[3-5]。為進一步研究ALEX1的功能，本研究成功構建人ALEX1基因的慢病毒表達載體并感染人乳腺癌細胞系SK-BR3細胞，為后期進行ALEX1基因的實驗研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑SK-BR3和293T細胞由本實驗室保存；RPMI1640 培養(yǎng)基(Hyclone 美國)；dsDNA oligo由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；慢病毒穿梭質粒LV5和包裝質粒 pGag/Pol、pRev、pVSV-G 購于上海吉瑪公司；E.Z.N.A.?膠回收試劑盒(Omega，美國)；E.Z.N.A.TM質粒提取試劑盒(Omega 美國)；限制性內切酶NotI和NsiI(TaKaRa，日本)；T4DNA連接酶(NEB 美國)；DNA marker(TaKaRa日本)；脂質體Lipofectamine 2000(Invi-trogen美國)；Western blot 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗人ALEX1多克隆抗體購自(Abcam 美國)；HRP標記的山羊抗兔IgG 抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體IgG(北京中杉生物有限公司)。RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒SYBRGreen，ExTaqTM聚合酶Ⅱ(TaKaRa日本)；ALEX1、GAPDH引物由TaKaRa公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1ALEX1基因獲取參考GenBank的ALEX1基因序列( NM_016608)設計出一對ALEX1基因引物序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成引物序列：ALEX1-NotI-F： 5′-GATTGGCGGCCGCGCCACCATGGGCCGCACTCGGGAAGC-3′(NotⅠ酶切位點標記為下劃線)。ALEX1-NsiI-R： 5′-GTATAATGCATTTAGAGTTTGGTTAATACTTTCAGGACT-3′；(Ns-iI酶切位點標記為下劃線)；按照試劑盒操作說明提取ALEX1 cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃30 s，60℃15 s，72℃15 s，30個循環(huán)回收并純化ALEX1編碼區(qū)片段。

1.2.2V-ALEX1重組質粒構建擴增和鑒定使用限制性內切酶NotⅠ和NsiⅠ線性化LV5載體，利用T4 DNA連接酶將線性化的LV5載體和目的基因ALEX1在連接緩沖液中16℃過夜連接。連接后的重組質粒轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基篩選后，挑取單克隆并擴大培養(yǎng)以進行質粒酶切鑒定，DNA測序鑒定獲取重組質粒V-ALEX1。

1.2.3重組慢病毒及陰性對照慢病毒的包裝和濃縮轉染前24 h，將生長狀態(tài)良好的293T細胞胰酶消化重懸接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿中；待細胞密度達到60%時，將重組慢病毒質粒V-ALEX1 和pGag/Pol、pRev、pVSV-G經(jīng)Lipofecta mine2000共轉染到293T細胞中，用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，換成含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。72 h后收集病毒上清液，4℃ 4 000 r/min，離心4 min；低速離心后用0.45 μm濾器過濾，4℃ 20 000 r/min超速離心2 h，收集濃縮液-80℃凍存。重組慢病毒命名為LV5-ALEX1，用上述相同方法將LV5與 pGag/Pol、pRev、pVSV-G 經(jīng)Lipofecta mine2000共轉染到293T細胞，并包裝成能表達GFP的慢病毒顆粒，命名為：LV5-NC作為陰性對照。

1.2.4病毒滴度測定293T細胞培養(yǎng)至80%～90%融合，胰酶消化重懸細胞，于96 孔板加入293T細胞1×104/孔，體積100 μl；取慢病毒原液10 μl，用10% FBS 的DMEM培養(yǎng)液10倍3～5個梯度，吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μl稀釋的病毒液，同時設立空白對照組，于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h；吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100 μl 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃ 5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72 h。通過流式細胞儀檢測熒光細胞，結合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.5LV5-ALEX1載體及對照載體感染SK-BR3細胞將成功包裝的ALEX1過表達慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細胞(MOI為10)72 h后，熒光顯微鏡下觀察感染效率。

1.2.6Real-time PCR檢測ALEX1 mRNA表達篩選后的細胞加入1 ml TRIzol，按照操作說明提取細胞總RNA并測定RNA濃度。以1 μg RNA為模板，按照RT-PCR逆轉試劑盒操作說明合成cDNA，以1 μl cDNA為模板，進行PCR反應。 反應條件：95℃10 s預變性，95℃5 s變性，60℃15 s退火，72℃15 s延伸，40個循環(huán)。引物序列：ALEX1：5′-TGATATTCTGAGTGCTCCCGACC-3′(上游)，5′-TGTTACCC-AGAGTGACCAAGGCT-3′ (下游)；GAPDH：5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′ (上游)，5′- GTAGAGGCAGGGATGAGTTCT-3′ (下游)。

1.2.5Western blot 檢測ALEX1蛋白表達以細胞裂解液裂解篩選后的細胞，提取細胞總蛋白，BCA法定量，取40 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入兔抗人ALEX1(1∶500 稀釋) 抗體，兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000)，4℃過夜，次日TBST洗膜10 min×5次，再分別與HRP標記的山羊抗兔二抗( 1∶3 000)室溫孵育2 h，TBST清洗10 min×5次，ECL化學發(fā)光。

1.3統(tǒng)計學分析使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，t檢驗分析各組ALEX1 mRNA相對表達量的差異，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1PCR擴增ALEX1PCR成功擴增出ALEX1序列的DNA片段，電泳可見大小約1 362 bp的特異性條帶(圖1)。

2.2重組質粒LV5-ALEX1的鑒定將PCR產(chǎn)物與經(jīng)NotⅠ和NsiⅠ內切酶線性化的LV5載體連接、轉化感受態(tài)細胞DH5α，提取質粒酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生了約1 500 bp的片段，片段大小與ALEX1基因cDNA大小一致(圖2)。

2.3LV5-ALEX1測序結果酶切鑒定正確的質粒取10 μl送上海生工基因測序。測序結果與預期ALEX1基因序列完全一致，測序證實獲取重組質粒V-ALEX1。

2.4慢病毒滴度測定的結果病毒滴度釆用逐孔稀釋法檢測，利用1、0.1和0.01 μl的慢病毒懸液分別感染293T細胞(1×104/孔)，72 h后觀察細胞熒光情況(圖3)。流式細胞儀檢測0.01 μl慢病毒懸液感染的293T細胞，其中GFP陽性細胞比率為42.5% (圖4)。經(jīng)計算，慢病毒滴度為104×42.5%/(0.01×10-3ml)=4.25×108TU/ml。

圖1　PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析結果Fig.1　Gel electrophoresis of PCR productNote: 1.ALEX1；2.Marker.

圖2　NotI/NsiI酶切重組質粒鑒定圖Fig.2　Map of recombinant plasmids digested by NotⅠ/NsiⅠNote: 1.ALEX1；2.Marker.

2.5LV5-ALEX1載體及對照載體感染SK-BR3細胞的效率將成功包裝的ALEX1過表達慢病毒載體(LV5-ALEX1)和陰性對照載體(LV5-NC)，感染SK-BR3細胞(MOI為10)，72 h熒光顯微鏡觀察細胞感染效率達到90%左右(圖5)。

2.6LV5-ALEX1載體及對照載體感染SK-BR3 細胞后ALEX1的表達利用Real-time PCR和Western blot檢測ALEX1的表達變化(P<0.01) (圖6，7)，Real-time PCR和Western blot數(shù)據(jù)結果顯示：

圖3　慢病毒LV5-ALEX1感染293T細胞(×100)Fig.3　Lentivirus LV5-ALEX1 infection in 293T cells(×100)

圖4　流式細胞術檢測慢病毒LV5-ALEX1的滴度Fig.4　Titer of lentivirus LV5-ALEX1 detected by flow cytometry

圖5　慢病毒LV5-ALEX1感染乳腺癌細胞的效率(×200)Fig.5　Efficiency of LV5-ALEX1 infection in breast cancer cells (×200)

圖6　Real-time PCR檢測ALEX1mRNA表達水平Fig.6　ALEX1 mRNA expression detected by real-time PCRNote: LV5-ALEX1 vs.LV5-NC,*.P<0.01.

圖7　Western blot檢測ALEX1蛋白表達水平Fig.7　ALEX1 protein expression detected by western blotNote: 1.LV5-NC;2.LV5-ALEX1.

與感染LV5-NC的SK-BR3細胞相比，LV5-ALEX1感染可明顯增加ALEX1在SK-BR3細胞mRNA和蛋白表達水平。

3討論

隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，改變基因表達水平的方法和手段日趨成熟。目前，利用慢病毒載體導入外源性基因的方法遠比普通質粒應用脂質體導入目的基因的手段更具轉染效率高及表達穩(wěn)定等優(yōu)點因而備受學者青睞[6]。慢病毒載體是將人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的全部HIV-1編碼基因刪除進而改造成的病毒載體系統(tǒng),能高效地將目的基因導入真核生物細胞中并隨著細胞不斷分裂持久且穩(wěn)定地表達目的基因[7]。本研究采用上海吉瑪公司提供的慢病毒表達系統(tǒng)。即1個穿梭質粒(LV5)和3個包裝質粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)。其中，穿梭質粒中包含目的基因的慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應基因組RNA的所有順式作用元件，可以穩(wěn)定表達目的基因。另外，三個輔助包裝質粒可以提供病毒包裝所需的反式作用因子，采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復制，從而確保慢病毒具備良好的生物安全性。

ALEX 蛋白是Arm蛋白家族的成員之一，因具有一或二個Arm repeat結構不同于經(jīng)典的Arm蛋白具有的6～13個Arm repeat結構而被單獨列為ALEX蛋白家族。其家族成員包括ALEX1，ALEX2和ALEX3[2,8,9]。基因表達分析顯示ALEX1 mRNA在人類多種正常組織中高表達而在上皮組織來源的癌組織低表達或不表達[1]。除此之外，Hiroyoshi Iseki 等[3,10]于2010年和2012年先后報道ALEX1基因受CREB和Wnt/β-catenin 通路調節(jié)并能夠抑制人直腸癌細胞的克隆形成。這些結果均表明ALEX1基因在上皮來源的腫瘤中發(fā)揮抑癌作用。 目前，ALEX1在乳腺癌中的表達及其作用機制仍不清楚。

為了使ALEX1基因能夠在乳腺癌細胞中穩(wěn)定表達，本實驗構建了ALEX1過表達慢病毒。我們利用PCR擴增得到目的基因ALEX1，利用T4 DNA連接酶將線性化的LV5載體和目的基因ALEX1連接，通過轉化、質粒提取，重組慢病毒質粒酶切鑒定和DNA測序最終鑒定重組質粒V-ALEX1構建成功。在包裝質粒輔助下，利用293T細胞成功包裝成ALEX1的過表達慢病毒載體(LV5-ALEX1)和相應的對照載體(LV-NC)。隨后利用上述病毒載體感染SK-BR3細胞，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)慢病毒LV5-ALEX1能高效地感染SK-BR3細胞，real-time PCR 和western blot 顯示LV5-ALEX1能顯著增加ALEX1 mRNA 和蛋白水平的表達。這些結果說明包裝的重組慢病毒載體LV5-ALEX1能有效介導ALEX1的過表達，為接下來研究過表達ALEX1對乳腺癌細胞生物學行為的影響以及其分子機制奠定了良好的實驗基礎。

參考文獻：

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[10]Iseki H,Takeda A,Andoh T.ALEX1 suppresses colony formation ability of human colorectal carcinoma cell lines[J].Cancer science,2012,103 (7):1267-1271.

[收稿2015-03-02修回2015-06-04]

(編輯許四平)

Construction and identification of ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vector

GAOYue,DENGXiao-Fang,LEIJi-Kui.

DepartmentofClinicalLaboratory,theChineseTraditionalMedicineHospitalofBeibeiDistrict,Chongqing400700,China

[Abstract]Objective:To construct ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vector and study expression of ALEX1 in SK-BR3 breast cancer cells after transfection,which is conducive to studying the function of ALEX1 in breast cancer.Methods: The ALEX1 gene was inserted into plasmid LV5 of lentiviral vector by recombinant DNA technology.Lentivirus vector V-ALEX1 was got after recombination.The combinant lentivirus vector was detected by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The recombinant lentiviral plasmid V-ALEX1 was transfected into 293T cells with the packaging plasmids including pGag/Pol,pRev and pVSV-G by Lipofecta mine 2000.The recombinant lentivirus expressing ALEX1 was obtained from the cells supernatant and the viral titer was tested by flow cytometry.The ALEX1-gene-over-expressed recombinant lentivirus (LV5-ALEX1) and negative control recombinant lentivirus (LV5-NC) were transfected into SK-BR3 cells.The expression of ALEX1 was detected by real-time PCR and western blot.Results: The results of recombinant plasmids digestion identification showed that the fragment is about 1 500 bp,which is the same size as ALEX1 gene cDNA fragments.The blast results of ALEX1 cDNA sequence showed that the sequencing results and expected ALEX1 gene sequence is completely consistent.It was confirmed that the ALEX1 was correctly inserted into the vector,and that ALEX1-gene-over-expressed lentivirus vectors was successfully constructed.After packing 293T cells,we successful got recombinant lentivirus LV5-ALEX1 with virus drops to 4.25×108 TU/ml.The results of real-time PCR and western blot showed that the expression of ALEX1 was significantly upregulated in mRNA and protein levels in LV5-ALEX1 group campared with LV5-NC group in SK-BR3 cells.Conclusion: The lentiviral vector over-expressing ALEX1 gene was successfully constructed,and lentivirus can transfect SK-BR3 cells and exnous gene was expressed stably.

[Key words]ALEX1;Lentivirus;Construction;Identification

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.017

作者簡介：高月(1974年-)，女，博士，主要從事腫瘤分子生物學方面的研究，E-mail:moon19740000@163.com。

中圖分類號R329.26；R329.28

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0678-04

①本文為遼寧省科技廳項目(2015020353)。