血漿纖溶酶原與BDNF在抑郁模型大鼠海馬區(qū)的表達及相關性研究*

林志雄，殷靜雯△，冼君定，顏海鋒，鄒曉波

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院精神心理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學院，廣東東莞 523808)

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血漿纖溶酶原與BDNF在抑郁模型大鼠海馬區(qū)的表達及相關性研究*

林志雄1，殷靜雯1△，冼君定2，顏海鋒1，鄒曉波1

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院精神心理科，廣東湛江 524001；2.廣東醫(yī)學院，廣東東莞 523808)

[摘要]目的探討血漿纖溶酶原和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)與抑郁癥的相關性，加深對抑郁癥發(fā)病分子機制的認識，為抑郁癥的診斷和治療提供新的思路。方法建立慢性輕度不可預見性應激大鼠抑郁模型，檢測大鼠快感缺乏，行為活動減少，體質(zhì)量減輕等抑郁樣癥狀。采用蛋白免疫印跡法分析大鼠海馬組織血漿纖溶酶原和BDNF蛋白表達情況。結果血漿纖溶酶原和BDNF在對照組和觀察組大鼠海馬區(qū)表達的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。血漿纖溶酶原與BDNF的變化呈明顯正相關(r=0.65,P<0.01)，線性回歸分析表明二者之間存在明顯的依存關系(r2=0.423),回歸方程為：YBDNF=0.750X血漿纖溶酶原+0.201。結論應激可影響神經(jīng)細胞的生長和存活，導致大鼠抑郁樣行為的發(fā)生。同時檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達下降，BDNF與血漿纖溶酶原的表達呈正相關，提示血漿纖溶酶原和BDNF共同參與抑郁癥的發(fā)病機制。

[關鍵詞]抑郁癥；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；血漿纖溶酶原

抑郁癥是臨床最常見的精神疾病之一，但是其發(fā)病機制尚未明確。近年有學者提出了抑郁癥的神經(jīng)營養(yǎng)假說(neurotrophin hypothesis of depression)，認為多種應激(壓力)能夠降低海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的信號調(diào)節(jié)作用(降低BDNF的表達)，使神經(jīng)細胞突觸數(shù)量減少和神經(jīng)細胞凋亡而引起抑郁；抗抑郁藥物能夠增強BDNF信號調(diào)節(jié)的作用(增強BDNF的表達)，提高突觸的可塑性和促進神經(jīng)元的生存來發(fā)揮治療抑郁的效果[1]，更進一步的研究提示，BDNF 表達又受到血漿纖溶酶原(plasminogen)的調(diào)節(jié)[2]。故此，推測血漿纖溶酶原可以通過調(diào)節(jié)BDNF來參與抑郁癥的發(fā)病與治療。

1材料與方法

1.1實驗動物Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，雄性，10周齡，體質(zhì)量(200±50)g。每籠4只，室溫(20±2)℃，光照12 h(6:00 ～18：00)和黑暗12 h(18:00～6:00)環(huán)境飼養(yǎng)，適應環(huán)境1周。采用區(qū)組隨機化分組方法，以體質(zhì)量作為配伍因素，分為對照組和觀察組，每組12只。

1.2方法

1.2.1大鼠抑郁模型采用慢性輕度不可預見性應激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS)。觀察組大鼠共接受21 d各種不同的隨機安排的應激刺激，包括：冰水游泳、室溫游泳、夾尾、整夜光照、潮濕墊料，采用無放回的抽簽法安排每周刺激，每天1種。

1.2.2行為學測驗以糖水消耗量，體質(zhì)量和曠場試驗作為行為學評分方法。分別在實驗處理前1天和造模第21天于隔音、安靜的房間施測。糖水消耗量測驗要求在訓練動物適應1%蔗糖24 h后，測定2 h內(nèi)糖水消耗量。曠場實驗：采用自制50 cm×50 cm×40 cm周邊不透明立方體敞箱，底面黑色并用白線劃分為25個面積相等的方格(10 cm×10 cm)。均在9：00～10:30進行實驗。室內(nèi)隔音并保持安靜，恒定光源，操作者將大鼠放入曠場正中格內(nèi)，用攝像設備記錄大鼠在5 min內(nèi)行為變化，包括水平運動(穿越格子數(shù))、垂直運動(站立次數(shù))、停留時間，四只爪子均進入一格記錄水平運動1次，兩前爪騰空或攀附墻壁記錄垂直運動1次。

表1　各組大鼠行為學評分

1.2.3標本采集及Western blot檢測采用脊椎脫臼法處死大鼠，將大鼠放置于冰上，快速剪毛、開顱，取出兩側海馬組織，液氮快速冷凍于-80 ℃冰箱儲存。將大鼠海馬組織研磨至組織完全裂解。將組織裂解液高速離心(4 ℃，10 000 r/min，15 min)；取淡黃清亮的蛋白上清液。BCA法測定蛋白濃度并調(diào)平，用移液槍將15 μL蛋白樣品液體和mark緩慢加入樣品孔中。用60 v進行濃縮膠電泳，30 min后再轉(zhuǎn)成恒壓120 v在分離膠中電泳，時間90 min。冰浴下，用恒流300 mA電流轉(zhuǎn)膜50 min，PBS-T浸洗。將膜用密封袋裝好，依次加入5%封閉蛋白、一抗封閉液，二抗封閉液，以上每一步后均放入0.5‰PBS-T中，用搖床揺洗5次，每次5 min，速率為90 r/min。全暗房內(nèi)曝光，將曝光好的膠片放入37 ℃烘箱中烤干。

2結果

2.1行為學評分應激前，兩組大鼠糖水消耗量、體質(zhì)量、曠場試驗水平運動得分、垂直運動得分和停留時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。試驗處理后，兩組糖水消耗量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，對照組體質(zhì)量增長率顯著高于觀察組(P<0.05)，觀察組水平運動得分和垂直運動得分顯著低于對照組(P<0.05)，觀察組停留時間顯著長于對照組(P<0.01)，見表1。

圖1　Western blot法檢測大鼠海馬組織血漿纖溶酶原和BDNF的表達

表2　Western blot檢測血漿纖溶酶原、BDNF在大鼠海馬組織中的表達±s)

2.2Western blot檢測血漿纖溶酶原和BDNF的表達對照組和觀察組大鼠海馬區(qū)血漿纖溶酶原和BDNF表達的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，見表2、圖1、2。血漿纖溶酶原和BDNF在大鼠海馬區(qū)的表達差異無統(tǒng)計學意義(t=0.67,P=0.51)。通過對數(shù)據(jù)進行相關與回歸分析顯示，血漿纖溶酶原與BDNF的變化呈明顯正相關(r=0.65,P<0.01)，它們之間存在明顯的依存關系，回歸方程為：YBDNF=0.750X血漿纖溶酶原+0.201。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖2Western blot 檢測BDNF、血漿纖溶酶原蛋白在大鼠海馬組織中的表達

3討論

實驗結果表明：應激可影響神經(jīng)細胞的生長和存活并出現(xiàn)快感缺失，行動能力減弱，體質(zhì)量減輕等一系列與抑郁相關的癥狀。同時檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達明顯下降，且兩者的表達呈正相關，提示血漿纖溶酶原和BDNF共同參與抑郁癥的發(fā)病機制。

3.1BDNF與抑郁癥相關評價試驗證實抑郁模型已經(jīng)造模成功后，檢測對照組和觀察組大鼠海馬中BDNF的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，本研究結果支持此結果，小鼠經(jīng)受21 d慢性輕度不可預見性應激后BDNF表達較對照組明顯減少。表明BDNF與抑郁相關，BDNF具有促進突觸生長、維持神經(jīng)元生存的作用。Taliaz等[3]通過RNA干擾技術進行BDNF基因敲除的小鼠研究還發(fā)現(xiàn)，海馬齒狀回部位BDNF表達下降直接減少了神經(jīng)細胞的生成，小鼠出現(xiàn)了抑郁樣行為。尸檢發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦內(nèi)海馬區(qū)BDNF較健康對照組顯著下降[4]。并且，腦內(nèi)BDNF水平上升可以產(chǎn)生抗抑郁效果。Hoshaw等[5]對兩種抑郁癥行為(強迫游泳和習得性無助)小鼠的中腦和海馬部位直接灌注外源性BDNF，發(fā)現(xiàn)其海馬部位會迅速且持久地產(chǎn)生類似抗抑郁作用。

BDNF通過維持神經(jīng)元的生存而防止抑郁癥的發(fā)生。可能的機制為：BDNF與酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine kinase B,TrkB)結合后可激活多條信號傳導通路，其中絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/Erk)通路的級聯(lián)反應最為重要[6]。首先Erk的激活在突觸可塑性調(diào)節(jié)中起著重要的作用[7]；其次，MAPK/Erk通路的級聯(lián)反應調(diào)控使cAMP反應性元件結合蛋白(cAMP response elementbinding protein,CREB)磷酸化，從而增加B淋巴瘤細胞-2 (B-cell lymphoma 2,Bcl-2)的合成，可抑制細胞凋亡[8-9]。

也有學者對BDNF與抑郁癥的關系提出質(zhì)疑。Pawlak等[10]對野生型C57/BL6小鼠連續(xù)施加21 d，每次6 h束縛性應激后(用金屬絲束縛頭部和夾尾)，檢測到神經(jīng)元的突觸減少，但BDNF的表達較對照組沒有顯著改變。這提示可能有多重途徑調(diào)節(jié)突觸神經(jīng)元的可塑性和存活。BDNF并不是惟一的調(diào)節(jié)因子[10]。

3.2血漿纖溶酶原與抑郁癥本實驗結果顯示，抑郁模型造模成功后，血漿纖溶酶原在海馬區(qū)的表達較對照組顯著減少，提示其含量與抑郁癥密切相關。Pawlak等[10]認為N-甲基-D-天冬氨酸受體 (N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)在神經(jīng)突觸可塑性中起著重要的作用，并且通過檢測生長相關蛋白(growth-associated protein,GAP-43)的表達和高爾基染色法觀察神經(jīng)元突觸的生長，在對血漿纖溶酶原(-/-)小鼠施加慢性束縛性刺激的實驗結果證實了血漿纖溶酶原向廣譜蛋白血漿纖溶蛋白酶(plasmin)轉(zhuǎn)換的過程是應激后NMDA受體減少的重要因素。另有學者的研究也證實血漿纖溶酶原可能通過其他分子通路調(diào)節(jié)抑郁癥。

3.3BDNF、血漿纖溶酶原與抑郁癥應激可以引起大腦，特別是海馬內(nèi)一系列的生化反應。長期應激引起的大腦結構、功能、分子機制的改變，可導致認知、情緒和行為的改變。本研究發(fā)現(xiàn)應激可影響神經(jīng)細胞的生長和存活并出現(xiàn)快感缺失，行動能力減弱，體質(zhì)量減輕等一系列與抑郁相關的癥狀。同時檢測到血漿纖溶酶原和BDNF的表達下降，二者的表達呈線性相關，表明血漿纖溶酶原與BDNF的表達均受到應激的影響。血漿纖溶酶原可能作為BDNF的上游調(diào)控因子，可能通過對BDNF水解過程的調(diào)控，參與抑郁癥的發(fā)病的生化過程[11]。血漿纖溶酶原的精氨酸561-纈氨酸562之間的肽鍵可以被t-PA裂解，形成有活性的plasmin[12]。plasmin是一種廣譜蛋白酶，在機體的凝血和纖溶反應中發(fā)揮著重要作用。plasmin可以水解pro-BDNF，將其轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腂DNF后，與酪氨酸蛋白激酶B(tyrosine kinase B,TrkB)結合，促進突觸的生長、維持神經(jīng)細胞生存[11]。而另一部分 pro-BDNF與神經(jīng)生長因子受體p75( p75 neurotrophin receptor,p75NTR)結合后會抑制突觸的生長，特別是當形成pro-BDNF/p75NTR/sortilin三聚體時，將會導致神經(jīng)細胞的凋亡[13-14]。血漿纖溶酶原和BDNF的表達水平?jīng)Q定著神經(jīng)細胞的生長和凋亡，與抑郁癥密切相關。

綜上所述，試驗運用慢性刺激施加于大鼠，模擬人類抑郁的發(fā)病過程建立抑郁模型后，觀察組大鼠表現(xiàn)出快感缺乏、行為活動減少、體質(zhì)量減輕等抑郁癥狀及海馬區(qū)發(fā)生病變，同時檢測到海馬內(nèi)血漿纖溶酶原和BDNF的表達較對照組顯著下降。進一步證實血漿纖溶酶原-BDNF通路維持神經(jīng)細胞的生長這一過程與抑郁癥相關。血漿纖溶酶原作為兩條通路的共同因子，可能成為研究抑郁癥發(fā)病機制和治療抑郁癥新的靶點。血漿纖溶酶原和BDNF的調(diào)控關系還需要在基因敲除小鼠中進一步驗證，同時本實驗中沒有進行NMDA受體通路的研究，不能排除NMDA受體通路和BDNF通路是否存在相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)血漿纖溶酶原大量存在于人的血液和組織液中，血液中和腦內(nèi)血漿纖溶酶原水平的相關性可能成為診斷和治療抑郁癥的重要依據(jù)，血漿纖溶酶原將有望成為抑郁癥的診斷標記因子。

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Study on plasminogen and BDNF expression in the hippocampus of depression rat mode and its relationship*

Lin Zhixiong1,Yin Jingwen1△,Xian Junding2,Yan Haifeng1,Zou Xiaobo1

(1.Department of Psychiatry，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China; 2.Guangdong Medical College,Dongguan,Guangdong 523808,China)

[Abstract]ObjectiveTo study on the relationship between plasminogen and brain-derived neurotrophic factor(BDNF),and explain the molecular mechanism of depression，then provide new clew for diagnosis and treatment of depression.MethodsThe chronic unpredictable mild depression rat mode was established，then depression symptoms including absence of delight，the decline of actions and activities， and weight reduction of rat were tested.The levels of individual plasminogen and BDNF in hippocampus were determined by Western blot.ResultsThe expression of BDNF and plasminogen in depression rat mode and control group was significantly different(P<0.01),and there was a positive correlation between BDNF and plasminogen(r=0.65,P<0.01).According to the linear-regression analysis ，there was a dependence relationship between them(r2=0.423).The equation of regression was YBDNF=0.750XPlasminogen+0.201.ConclusionStress could affect the growth and survival of nerve cell,which lead to the depression behavior of rats,meanwhile,the decline of plasminogen and BDNF levels，the positive correlation between them illustrate that plasminogen and BDNF take part in the mechanism of depression.

[Key words]depressive disorder;brain-derived neurotrophic factor;plasminogen

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.09.006

* 基金項目：湛江市科技攻關計劃項目(2013B01039)。

作者簡介：林志雄(1974-)，學士，主任醫(yī)師，主要從事抑郁癥的臨床與基礎研究。△通訊作者,E-mail:amysays@live.cn。

[中圖分類號]R749.4+1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)09-1170-03

(收稿日期：2015-09-28修回日期：2015-12-22)