靈芝三萜類化合物對AD大鼠海馬神經元凋亡的影響*

張　玥， 羅　俊， 黃能慧， 張小毅

(貴州醫科大學 藥理學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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靈芝三萜類化合物對AD大鼠海馬神經元凋亡的影響*

張玥， 羅俊**， 黃能慧， 張小毅

(貴州醫科大學 藥理學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究靈芝三萜類化合物(GLT)對阿爾茨海默病(AD)模型大鼠腦細胞凋亡的影響。方法: 將自然衰老模型大鼠60只隨機均分為 GLT低、中、高劑量組，模型組，溶媒對照組(食用油)及陽性對照組(健腦膠囊),5月齡大鼠10只為正常對照組；連續灌胃給予相應藥物60 d，取各組大鼠海馬組織HE染色觀察神經元變化，TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經細胞凋亡。結果: 與正常對照組比較，模型動物腦海馬神經細胞損傷明顯，細胞排列極度紊亂，大小形態不規則，數量明顯減少，海馬凋亡陽性細胞數顯著增多，差異具有統計學意義(P<0.05)，神經細胞核內有大量深染棕黃色顆粒狀；給予GLT后，神經細胞損傷減輕，GLT高劑量組無明顯神經細胞壞死特征;與模型組比較，GLT中、高劑量組大鼠海馬凋亡陽性細胞數減少(P<0.05)，神經細胞核淺染棕黃色顆粒。結論: GLT可減少AD大鼠海馬神經元凋亡，這可能是防治AD的機制之一。

[關鍵詞]海馬； 阿爾茨海默??； 衰老； 細胞凋亡； 靈芝三萜類化合物

阿爾茨海默病(alzheimer disease, AD)是一種老年人神經系統退行性疾病，起病潛隱，臨床主要表現為嚴重的認知和記憶功能減退，并伴有進行性的記憶、智能、言語、視空間技能障礙及人格改變等[1]。AD的病因和發病機制不明確，臨床多采用細胞代謝激活劑等藥物改善腦細胞功能，無特異性治療藥物及方法。本課題組前期研究表明靈芝主要有效成分—靈芝三萜類化合物(Ganodermalucidumtriterpenoids，GLT)能提高AD自然衰老模型大鼠的學習記憶能力，其機制可能是通過改善AD大鼠腦內能量代謝，提高總抗氧化能力，降低乙酰膽堿酯酶活力，升高乙酰膽堿轉移酶活力等起效，本文觀察GLT對AD模型大鼠腦細胞凋亡的影響。

1材料與方法

1.1材料

GLT(中科院地化所提取)，健腦膠囊 (JNJN，青島國風藥業公司)，TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒(武漢 BOSTER公司)及BIOMIAS-99圖像分析系統(四川大學圖像圖形研究所)。SD大鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1AD大鼠篩選取24月齡SD大鼠100只和5月齡大鼠10只進行Morris水迷宮實驗，以5月齡大鼠的逃避潛伏期均數加2倍標準差為判別AD的標準，24月齡大鼠大于該值的為AD大鼠[2]。

1.2.2分組篩選出的60只AD大鼠隨機分為模型組(NS 10 mL/kg)、GLT低劑量組(0.25 g/kg)、GLT中劑量組(0.5 g/kg)、GLT高劑量組(1.0 g/kg)、溶媒對照組(食用油10 mL/kg)及陽性對照組(健腦膠囊 0.38 g/kg)，每組10只，雌雄各半；以5月齡大鼠為正常對照組(NS 10 mL/kg)。每日1次灌胃給藥，連續60 d。

1.3觀察指標

給藥結束后，各組大鼠迅速于冰臺上0℃下斷頭取出大腦，取視交叉后 5 mm厚的冠狀位腦片(包含海馬)，石蠟包埋，連續冠狀切片，每例標本切片分別作HE染色觀察海馬細胞；TUNEL法(按試劑盒操作)檢測海馬神經凋亡細胞并計數：每張切片(每例動物標本)隨機選取5個400倍視野，以5個視野陽性細胞數的平均值作為一例標本的陽性表達細胞數。

1.4統計學方法

2結果

2.1大鼠海馬組織病理學

圖1顯示，正常對照組大鼠海馬神經細胞排列整齊，形態規則，胞體為類圓形；細胞結構完整，胞膜、胞核輪廓清晰；神經細胞無明顯腫脹及壞死。模型組及溶媒對照組大鼠海馬神經細胞排列極度紊亂，大小形態不規則，神經細胞數量明顯減少，細胞腫脹，結構輪廓模糊，有明顯神經細胞空泡樣變性改變(細胞漿染色變淺，其內有大小不等圓形或類圓形空泡，有明顯的神經細胞壞死表現)；核結構模糊、向一側固縮、碎裂或溶解消失。GLT低、中劑量組及陽性藥對照組大鼠海馬神經細胞排列輕度紊亂；GLT高劑量組神經細胞大小形態規則，細胞數量較多，細胞結構完整，胞膜、胞核輪廓清晰，細胞體積稍增大、無明顯腫脹，少量神經細胞空泡變性，無明顯神經細胞壞死特征。

2.2大鼠海馬神經細胞凋亡

顯微鏡下可見細胞核呈棕黃色顆粒狀改變(凋亡小體)的為凋亡陽性細胞(箭頭所示)。與正常對照組比較，模型組大鼠海馬凋亡陽性細胞數顯著增高，差異有統計學意義(P<0.01)，神經細胞核內有大量深染棕黃色顆粒狀；與模型組相比，GLT中、高劑量組及陽性對照組海馬凋亡陽性細胞數降低，神經細胞核淺染棕黃色顆粒(圖2、表1)。

表1　各組大鼠海馬神經細胞凋亡情況±s)

(1)與正常對照組比較，P<0.01;(2)與模型組比較，P<0.05

3討論

有關AD的發病機制研究很多，研究已證實基因突變、腦內膽堿能傳遞功能紊亂、自由基損傷、Aβ沉積、神經元凋亡等因素可能在AD的發病中起關鍵性作用。習慣所稱靈芝屬中赤芝的子實體部分。靈芝具有廣泛的藥理活性，主要有效成分之一是GLT[3-5]。本文旨在觀察GLT對AD大鼠組織細胞凋亡的影響，從而研究該藥對AD有無防治功能，并探討其可能的作用機制。建立理想的模型是研究的重要環節，本研究采用自然衰老認知障礙模型，更符合衰老因素在AD發病過程中的重要作用[6]。AD的病理學改變有老年斑(senile plaque, SP)、神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFT)、大量神經元丟失及顆粒空泡變性等。在某些神經變性疾病中， 一個明顯的病理特征是神經元的缺失，其中細胞凋亡起了主要作用，特別是在AD中[7]。本研究結果表明：自然衰老模型大鼠形態學方面，腦組織切片HE染色可見神經細胞腫脹、壞死，胞漿空泡樣變性等改變；在神經生化學方面，神經細胞凋亡數增多。以上結果表明，本實驗建立的AD模型組織病理學以及神經生化學變化方面模擬出與AD相似的特征。自然衰老模型大鼠用GLT灌胃2個月后，腦神經元壞死減少，細胞凋亡數減少，表明GLT能夠保護AD自然衰老模型大鼠腦組織，減輕大腦神經損傷。

注：A為正常對照組，B為模型組，C為溶媒對照組，D、E及F為GLT低、中及高劑量組，G為陽性對照組圖1　各組大鼠海馬神經細胞(HE,×400)Fig.1　The pathology examination of hippocampus in rats

注：A為正常對照組，B為模型組，C為溶媒對照組，D、E及F為GLT低、中及高劑量組，G為陽性對照組圖2　各組大鼠海馬細胞凋亡情況 (TUNEL,×400)Fig.2　Apoptosis of the hippocampus cells of aging rats

細胞凋亡是AD重要的神經病理學特性。大量的研究表明，在AD發病過程中，細胞凋亡起主導作用,AD患者腦內細胞丟失的機制可能與細胞凋亡有關[8]。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質的濃縮和碎片的形成，但這種現象出現晚且時間短暫。凋亡的特征是內源性核酸內切酶被激活，細胞自身的染色質或DNA被切割，出現單鏈或雙鏈缺口，并產生與DNA斷點數

目相同的3’-OH末端，通過TUNEL法可以檢測凋亡細胞。本實驗中，AD模型動物組腦組織HE染色顯示神經元變性、壞死及丟失較正常對照組顯著增多，予GLT治療后，GLT治療組動物腦組織神經元變性、壞死及丟失明顯減少，與模型組有顯著性差異；與正常對照組相比，模型組動物腦組織TUNEL陽性凋亡細胞數顯著增加，GLT治療后，TUNEL陽性凋亡細胞數較模型組明顯減少；提示GLT能減少AD神經元細胞損傷、壞死、丟失，抑制細胞凋亡。

本研究結果表明GLT對AD有防治作用，其可能的作用機制與減少腦神經元壞死、抑制細胞凋亡有關。

4參考文獻

[1] 吳文寶,孔慶宏,闞祥緒，等.凋亡通路及caspases 在阿爾茨海默病中作為治療靶點的研究[J].中國藥理學通報， 2015(11):1496-1501.

[2] 盛樹力.老年性癡呆：從分子生物學到臨床診治[M]. 北京：科學技術文獻出版社， 1998:351-352.

[3] 陳慧，楊海龍，劉高強. 靈芝三萜的生物合成和發酵調控[J].菌物學報， 2015(1): 1-9.

[4] 林志彬.中西醫結合研究詮釋靈芝的扶正固本功效[J].福建中醫藥大學學報, 2010 (6):1-6.

[5] 李欽艷，陳逸湘，鐘瑩瑩. 靈芝主要活性成分及其功能的研究進展(綜述)[J].食藥用菌， 2015(2):86-91.

[6] 趙保勝，徐暾海．老年性癡呆疾病模型的建立[J]．中國實驗方劑學雜志， 2011(6):274．

[7] 李建，王芳，周軍，等.丹參酮IIA對AD大鼠腦組織p53，pp53 表達及細胞凋亡的影響[J].中南大學學報:醫學版, 2015(11):1210-1216.

[8] 侯雪芹,張磊,林雅萍,等.4種阿爾茨海默病動物模型行為學改變及凋亡機制的比較[J]．中國老年學雜志, 2015(12):3185-3187.

(2016-01-12收稿，2016-04-28修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙毅

Effects of Ganoderma Lucidum Triterpenoids on Apoptosis of Brain Tissue of Alzheimer Disease Model Rat

ZHANG Yue， LUO Jun， HUANG Nenghui， ZHANG Xiaoyi

(DepartmentofPharmachology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the protective effects and mechanism of Ganoderma lucidum Triterpenoids (GLT) in Alzheimer Disease model rats. Methods: 60 natural aging rats were randomly divided into 6 groups, GLT low dose group, GLT middle dose group, GLT high dose group, model group, solvent group (edible oil) and positive group (JNJN). 10 rats of 5 months of age were used as control group. Then the intragastric administration was used. After being treated with GLT for 60 days, brain tissues were stained with Hematoxylin-eosin to observed, and the numbers of apoptotic neuron in hippocampus were tested by TUNEL. Results: Neurons were damaged in the brain, cell display were extremely messed with irregular size and shapes and the number of cells decreased in model rats. Hippocampus apoptotic positive cells increased significantly, large amount of dark brown particles were found in neuro cell nucleus; GLT high dose group showed no significant neuro cell apoptosis features; comparing with model group, middle and high dose group showed decreased hippocampus apoptotic positive cells(P<0.05), light brown particles were found in neuro cell nucleus. Conclusion: GLT can decrease necrosis of neuron and inhibit apoptosis，it maybe the mechanisms of protecting AD model animals.

[Key words]hippocampus; Alzheimer disease; natural aging; apoptosis; Ganoderma lucidum Triterpenoids

*[基金項目]教育部科學技術研究重點項目(V200801); 貴州省科技攻關項目(黔科合2004NGY031); 貴州省優秀科技教育人才省長專項資金(2005293)

[中圖分類號]R285.5； R749.6

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)05-0532-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.009

**通信作者 E-mail:luojun@ gmc.edu.cn

網絡出版時間：2016-05-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2141.052.html