原發性肝癌病人抑郁與血管生成的相關性研究

張　彧,謝　娟,徐　瑞,李麗娜,阮之平

原發性肝癌病人抑郁與血管生成的相關性研究

張彧,謝娟,徐瑞,李麗娜,阮之平

摘要:[目的]探索原發性肝癌抑郁對腫瘤進展的影響，為原發性肝癌伴抑郁病人的護理提供理論基礎。[方法]采用Hamilton抑郁量表(HAMD)和Zung抑郁自評量表對原發性肝癌病人做心理篩查;酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測病人血清中氧化應激指標和血管生成指標;利用體外培養系統,檢測原發性肝癌伴抑郁病人的血清對血管內皮細胞增殖及遷移的影響;追蹤原發性肝癌病人血清氧化應激及血管生成對原發性肝癌病人無進展生存期及總的生存期的影響。[結果]血管內皮生長因子(vascular endothelial growth fator,VEGF)在原發性肝癌伴抑郁病人中的表達顯著高于其非抑郁病人中的表達水平(P<0.05);體外實驗證明原發性肝癌伴抑郁病人的血清能夠有效促進血管內皮細胞的增殖和遷移能力;原發性肝癌病人抑郁水平、血清氧化應激水平及VEGF水平與病人的生存期呈負相關。[結論]原發性肝癌病人抑郁水平與血清VEGF呈正相關,與病人的預后呈負相關。

關鍵詞:原發性肝癌;抑郁;氧化應激;血管生成

原發性肝癌(primary liver cancer)是第5位常見的惡性腫瘤,全世界每年有約600 000人死于該疾病,占據腫瘤相關死亡率的第3位[1]。我國的肝癌發病人數約占全世界的55%;死亡率僅次于肺癌,位居第2位。由于原發性肝癌的起病隱匿、進展快、預后差、治療效果不理想,在原發性肝癌病人中,抑郁的發生比例非常高[2]。近年來,由于對腫瘤病人心理因素的重視,一門新興學科——腫瘤心理學得到長足發展[3]。腫瘤心理學認為惡性腫瘤屬心身疾病,腫瘤的發生、發展與個性心理特征、情緒障礙、生活習慣、社會矛盾等有關。氧化應激對腫瘤血管生成的促進作用[4]越來越受到人們的重視。研究認為活性氧(ROS)對血管形成的促進作用源于在蛋白及信使核糖核酸(mRNA)水平上調了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth fator,VEGF)的表達[5]。現有的研究可以證實抑郁與腫瘤的死亡相關,明確氧化應激參與了抑郁的病理、生理過程[6-8],而氧化應激會促進腫瘤血管的生成[9-11],那么在肝癌伴抑郁的病人中,會不會因較高的氧化應激水平而存在更強的腫瘤血管生成活性,由此影響病人的無進展生存期及總的生存期呢？本研究擬通過心理測評分組,動態觀察原發性肝癌伴或不伴抑郁病人其氧化應激水平的差異,對比分析抑郁程度和血清VEGF的關系,旨在了解肝癌抑郁情緒與腫瘤血管生成之間的關系,并有望為心身疾病的發生、發展提供新的研究方向。

1資料和方法

1.1一般資料研究對象為2012年—2014年陜西省腫瘤醫院住院病人40例。納入標準:符合世界衛生組織(WHO)原發性肝癌診斷標準;尚未進行或1個月內未行化療、放療及手術者;Karnofsky功能狀態評分≥60分;預計生存期≥3個月。排除標準:入組前1個月曾服用抗抑郁及抗氧化劑;既往有精神病史者;有智能障礙者;藥物、煙酒依賴者;患有感染或其他嚴重軀體疾病者。設立兩個研究組,每組20例,兩組病人的年齡、性別、病理分型、臨床分期、腫瘤大小及數目均差異無統計學意義(P>0.05)。依據Hamilton 17項抑郁量表(HAMD,評分≥18分)和Zung抑郁自評量表(SDS,標準分≥50分)做心理篩查。病人簽知情同意書,臨床研究內容符合《赫爾辛基宣言》及倫理委員會規定。

1.2試劑和儀器M199培養基購自Gibco BRL公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Hyclone公司;96孔板和細胞培養皿購自Costar公司;Transwell小室購于Corning公司,基質膠購自日本BD公司。條件培養基制備:抽取病人全血5 mL,分離得到血清,并于1 000 rpm離心5 min 清除殘留細胞,于-80 ℃保存備用。

1.3酶聯免疫吸附實驗(ELISA)分別將病人血清加入不同濃度標準品(3 200 pg/mL、1 600 pg/mL、800 pg/mL、400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL)各100 μL,37 ℃孵箱孵育2 h,洗滌5次,加入50 μL鼠抗人VEGF工作液,37 ℃孵箱孵育1 h,洗滌,加入100 μL酶標抗體工作液,37 ℃孵箱孵育1 h,每孔加入100 μL底物工作液,混勻37 ℃避光孵育10 min,加入50 μL中止液混勻后在492 nm處測吸光值。根據標準品濃度得到標準曲線和回歸方程,計算得到待測樣品VEGF含量。

1.4四甲基偶氨唑鹽比色法(MTT)實驗將人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)按1×104/mL的密度150 μL接種于96孔板中,待細胞貼壁后,去除培養基,換成含有抑郁肝癌病人或者非抑郁肝癌病人血清的條件培養基(血清量∶完全培養基為1∶1)繼續培養直至7 d。以M199完全培養基為陽性對照。MTT法檢測各組細胞的吸光值。

1.5細胞遷移實驗胰酶消化HUVEC細胞成單細胞懸液,用含1%胎牛血清的M199培養基重懸,按1×104/mL的密度100 μL接種于Transwell上層小室。吸取各種條件培養基500 μL加入Transwell下層小室,置于37 ℃,5%CO2培養箱中培養24 h。以M199完全培養基為陽性對照。用棉簽蘸磷酸緩沖鹽溶液(PBS)輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長但未能穿過膜的細胞。將膜取出放入預先裝有95%乙醇的24孔板內固定10min。吸棄乙醇,加0.1%的結晶紫染色30 min,用PBS小心洗去多余的染料,翻轉聚碳酸酯膜,小心撕下,晾干,置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大鏡下隨機觀察并計10個視野內穿過聚碳酸酯膜的細胞數,照相記錄。

1.6評價內容與方法原發性肝癌病人抑郁水平與氧化應激及VEGF表達的相關性研究,為了研究原發性肝癌病人抑郁水平對病人疾病進展及預后的影響,首先原發性肝癌病人抑郁水平與病人血管生成之間的關系,試圖探討與完善肝癌疾病進展的精神心理因素。通過提前設定好的臨床病例篩選標準,結合抑郁量表的評估將研究對象分為原發性肝癌伴抑郁組和不伴抑郁組,通過臨床生化試驗檢測病人血清中氧化應激指標,包括ROS、超氧化物歧化酶(SOD)，血管生成指標通過ELISA方法檢測血清VEGF水平。采用MTT實驗檢測來源于原發性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人的血管內皮細胞增殖能力;采用trans-well小室侵襲實驗檢測來源于原發性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人的血管內皮細胞侵襲能力。

2結果

2.1原發性肝癌病人抑郁水平與氧化應激及VEGF表達的相關性研究原發性肝癌抑郁組病人血清氧化應激指標ROS顯著高于原發性肝癌非抑郁組的病人,SOD水平低于非抑郁組(P<0.05)，血管生成指標VEGF在抑郁組病人中顯著高于非抑郁組的原發性肝癌組(P<0.05),見表1。相關分析顯示：原發性肝癌病人血清中ROS與VEGF水平呈正相關(r=0.678，P<0.05)，SOD則與VEGF呈負相關(r=-0.721，P<0.05)。

表1　兩組原發性肝癌病人氧化應激及VEGF表達水平

2.2原發性肝癌病人血清中氧化應激物對血管內皮細胞增殖和遷移能力的影響分離兩組原發性肝癌病人的血清(每組選擇3例病人分別進入研究,最終以實驗結果的平均值進行比較分析)與完全培養基共培養血管內皮細胞HUVEC,通過細胞增殖能力和遷移能力評價,結果來源于伴有抑郁病人的血清培養的血管內皮細胞的增殖能力顯著高于非抑郁組(P<0.05),見圖1;抑郁組細胞遷移能力也顯著高于非抑郁組的遷移能力(P<0.05),見圖2。

圖1　抑郁對原發性肝癌病人血清血管內皮細胞增殖的影響

圖2　抑郁對原發性肝癌病人細胞遷移能力的影響

2.3原發性肝癌病人抑郁水平、氧化應激及VEGF水平對病人預后的影響通過對入選的肝癌病人進行了為期3年的隨訪。結果顯示：原發性肝癌抑郁組病人的生存期(5.24個月±0.15個月)較原發性肝癌非抑郁組病人(8.12個月±0.21個月)顯著降低(P<0.05)，并且呈負相關(r=-0.592,P<0.05)。進一步分析氧化應激指標及VEGF與病人生存時間的相關性：原發性肝癌病人ROS和VEGF均與病人的生存時間呈負相關,相關系數分別為-0.782,-0.845,SOD與病人的生存時間呈正相關,相關系數為0.692(P<0.05)。以上結果提示原發性肝癌病人抑郁程度及血清中氧化應激及VEGF指標可能作為病人的預后的影響因素。

3討論

隨著國民素質及病人認知度的提高,腫瘤科護士的護理對象中絕大多數對自己的病情有充分的認知,這使病人可以更好地了解疾病轉歸并積極配合治療。另一方面對于那些惡性程度高、預后差的腫瘤病人,疾病確診的同時,病人的心理也會產生急劇變化,常見抑郁等不良情緒。

氧化應激是由于機體或細胞內ROS的產生與內源性抗氧化防御之間的不平衡引起。該過程引發氧化損傷,促進ROS依賴的信號轉導通路的調控而導致細胞表型的特異性改變等[11-12]。這一過程參與了細胞的凋亡、壞死及細胞增殖及腫瘤發生的多種病理生理過程[13]。在肝臟組織中氧化應激可以導致細胞的死亡及肝細胞的再生,從而直接導致肝臟中具有高度增殖活性、基因組不穩定性、高遷移性及高度成血管活性等致癌性的優勢克隆出現[9]。而氧化應激對腫瘤血管生成的促進作用[4]越來越受到人們的重視[14-16]。研究認為ROS對血管形成的促進作用源于在蛋白及mRNA水平上調了VEGF的表達[9]。VEGF是血管內皮細胞特異的生長因子,不僅能刺激內皮細胞有絲分裂、增殖和存活,增加血管通透性,參與腫瘤血管生成,還直接與腫瘤浸潤和轉移有關,是迄今所發現的最強、最特異的促血管生成因子之一,在腫瘤新生血管形成過程中起關鍵作用[17-18]。它由腫瘤細胞或侵入腫瘤的巨噬細胞和肥大細胞產生,可以通過自分泌方式作用于腫瘤細胞本身,直接促進腫瘤生長,或通過旁分泌方式結合于血管內皮細胞,促進血管內皮細胞增殖、遷移并誘導新生血管生成[19]。肝癌是一種典型的富血供的實體腫瘤,腫瘤血管生成和血管侵犯是肝癌的重要病理學特點之一,具有生長快、惡性程度高、易發生肝內播散、易復發和轉移,預后差等臨床病理特征,與其有較強誘導腫瘤血管生成能力有關[20]。除了在肝癌組織中VEGF高表達,肝癌病人的血清和血漿中也存在高濃度的VEGF[21]。一項有60例肝癌病人入組的實驗表明：血清VEGF含量和血小板計數的比值與腫瘤細胞中VEGF含量呈明顯正相關,同時還發現,腫瘤細胞中VEGF含量、血清 VEGF含量及血清VEGF含量和血小板計數比值越高意味著肝癌病人的臨床分期越晚[22]。另外一項有105例肝癌病人入組的實驗表明,血清VEGF含量與肝癌門脈浸潤和臨床分期密切相關,具有高水平VEGF(>245.0 pg/mL)的病人無病生存期較低水平VEGF病人短,總體預后差[23]。因此,VEGF 在肝癌血管生成中發揮了重要作用,是肝癌血管生成的中心環節,同時也是肝癌侵襲轉移過程中的關鍵分子[24]。

眾所周知,癌癥作為機體組織病變,腫瘤相關基因異常等環境因素和心理因素相互作用的疾病已得到廣泛的認可,其中不良心理因素及應激反應對腫瘤的進展具有一定的促進作用。同時,癌癥病人在接受治療過程中,心理因素起著不可忽視的作用。然而目前對癌癥病人確診初期,治療過程及臨終整個過程的心理護理及疏導仍然不夠全面與普及。本研究闡述了原發性肝癌伴抑郁和不伴抑郁病人氧化應激水平與癌癥進展相關因素血管生成的關系,對個體化的臨床診療及護理提供理論依據和量化指標。

本研究證實了抑郁與肝癌腫瘤病人的預后相關,提示肝癌伴抑郁的病人中,較高的氧化應激水平,使得病人具有更強的腫瘤血管生成活性,由此影響病人的無進展生存期及總的生存期。值得注意的是原發性肝癌伴抑郁病人血清氧化應激水平與病人血清VEGF相關,說明了肝癌抑郁情緒與腫瘤血管生成之間的關系,并有望為心身疾病的發生、發展提供新的研究方向。

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(本文編輯孫玉梅)

Correlation study between depression and angiogenesis in patients with primary liver cancer

Zhang Yu,Xie Juan,Xu Rui,et al

(Shaanxi Provincial Tumor Hospital,Shaanxi 710061 China)

基金項目陜西省科技廳社發公關項目,編號:2013K12-03-15。

作者簡介張彧,主管護師,碩士研究生，單位：710061,陜西省腫瘤醫院;謝娟、徐瑞、李麗娜單位:710061,陜西省腫瘤醫院;阮之平(通訊作者)單位：710061,西安交通大學醫學院第一附屬醫院。

中圖分類號：R473.73

文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-6493.2016.16.032

文章編號：1009-6493(2016)06A-2018-04

(收稿日期:2015-06-30;修回日期:2016-05-08)