LSD1和KDM5家族在卵巢癌細胞中的表達及LSD1對細胞增殖遷移的影響

賈超，王潔，邵根寶，陸祖宏

(1. 東南大學生物科學與醫學工程學院 生物電子學國家重點實驗室，江蘇 南京 210096； 2. 南京農業大學

LSD1和KDM5家族在卵巢癌細胞中的表達及LSD1對細胞增殖遷移的影響

賈超1，2，王潔3，邵根寶3，陸祖宏1

(1. 東南大學生物科學與醫學工程學院 生物電子學國家重點實驗室，江蘇 南京 210096； 2. 南京農業大學

動物科技學院，江蘇 南京210095； 3.江蘇大學 醫學院，江蘇 鎮江212013)

[摘要]目的:研究賴氨酸特異去甲基化酶1(LSD1)和賴氨酸去甲基化酶5家族(KDM5家族成員)在人卵巢癌細胞中的表達，分析LSD1對細胞增殖遷移的影響。方法:在3種卵巢癌細胞株中，分別用RT- PCR檢測LSD1、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D的mRNA的表達，蛋白質印跡法檢測前4種酶的表達；在人正常卵巢上皮細胞和癌細胞株中，采用蛋白質印跡法檢測LSD1的表達；用MTT法檢測LSD1對卵巢癌細胞株增殖的影響；應用劃痕試驗檢測LSD1對卵巢癌細胞株遷移的影響。結果:在3種人卵巢癌細胞的上述5種酶中，LSD1表達水平最高(P<0.01)，KDM5家族成員在不同細胞系中差異表達。LSD1抑制劑反苯環丙胺處理卵巢癌細胞后，用MTT法發現抑制LSD1能顯著降低癌細胞增殖(P<0.05)，刮痕實驗發現該藥物可顯著抑制卵巢癌細胞的遷移(P<0.05)。結論:LSD1在卵巢癌中高表達，KDM5家族差異化表達；LSD1與卵巢癌細胞系的增殖和遷移能力密切相關。

[關鍵詞]賴氨酸特異去甲基化酶； 卵巢癌； 細胞增殖； 細胞遷移

組蛋白甲基化修飾可以激活或抑制基因的表達，其修飾狀態的異常變化與多種癌癥密切相關[1- 3]。賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine- specific demethylase，LSD1)特異性去除組蛋白p第4位賴氨酸(pK4)的單甲基(me1)和二甲基(me2)修飾[4]，而賴氨酸去甲基化酶KDM5家族可以去除pK4的二甲基(me2)和三甲基修飾(me2)[5]，從而調節基因的轉錄活性。研究表明LSD1在多種癌癥中高表達，與癌細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關[6- 8]。KDM5家族包含KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D共4個成員[1]；其在乳腺癌[9]、前列腺癌[10]、胃癌[11]、肺癌[12- 13]、肝癌[14]、急性淋巴細胞白血病[15]等多種惡性腫瘤中高表達，成為目前癌癥表觀遺傳學研究的新熱點。而抑制LSD1與KDM5的活性可以影響相應腫瘤細胞的增殖、遷移和轉化，作為腫瘤診斷標記或治療藥物的靶點，LSD1和KDM5受到越來越多的關注[1，7]。

我們在前期研究[6]中發現，表皮生長因子(EGF)可以在翻譯水平上調LSD1蛋白的表達，而不依賴于mRNA水平的變化；并且在不同卵巢癌細胞系中，EGF1對pK4me2影響存在差異，意味著除LSD1外，其他賴氨酸去甲基化酶可能在發揮著調控作用。本研究對卵巢癌細胞以及正常卵巢上皮細胞系中的LSD1和KDM5，在mRNA和蛋白水平均進行表達分析；同時分析LSD1對卵巢癌細胞增殖遷移的影響。

1材料與方法

1.1材料

Transwell小室為美國Corning公司產品；DMEM培養液和胰蛋白酶為Gibco公司產品；逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司；實時熒光定量PCR相關酶購自Bio- Rad公司；抗體LSD1、KDM5A、KDM5B、KDM5C、β- actin均購自美國CST公司；LSD1抑制劑反苯環丙胺(TCP)購自美國Sigma公司。人卵巢表層上皮細胞(HOSEpiC)購自美國ScienCell，人卵巢癌細胞株SKOV- 3購自美國ATCC，HO8910和3AO由江蘇大學基礎醫學研究所保存，相關引物由上海生物工程公司合成(引物序列信息可與第一作者或通信作者聯系)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養SKOV- 3、HO8910、3AO 細胞接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中，置于37℃、體積分數為5%CO2飽和濕度培養箱中傳代培養。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖活性用單個細胞懸液，以每孔2×103～3×103個細胞接種到96孔板。待貼壁后分別加入0、25、50、100、500μmol·L-1TCP并繼續培養24 h；每孔加MTT溶液20μl繼續孵育4 h后終止培養，每孔加150μl DMSO，選擇490nm波長測定各孔光吸收值[16]。

1.2.3實時熒光定量檢測取對數生長期細胞進行胰酶消化，離心后收集細胞。采用Trizol法提取細胞總RNA，用cDNA作為模板，RT- PCR檢測mRNA表達水平。

1.2.4蛋白質印跡法檢測取30～50μg蛋白樣品，8% SDS變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS- PAGE)電泳分離，轉至PVDF膜，以5%脫脂牛奶封閉后加一抗4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育60min后ECL顯色，設β- actin為內參。

1.2.5細胞劃痕實驗將對數生長期的細胞消化后接種于24孔培養板中，每孔接種細胞約5×104個，置37℃、體積分數為5% CO2培養箱中培養24 h。用100 μl移液器吸頭沿孔板的中軸輕劃出一道痕，用PBS洗去漂浮細胞。培養24 h后拍照，利用目鏡刻度尺測量劃痕的前(S0)、后(S1)寬度，計算遷移率(migration rate，MR)。MR(%)=[(S0-S1)/S0]×100%

1.3統計學處理

采用Quantity One 4.5軟件進行半定量分析，計量資料用平均值±標準誤表示，進行t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1組蛋白去甲基化酶在卵巢癌細胞株中的表達

mRNA水平的表達分析發現，在SKOV- 3、HO8910、3AO 3種人卵巢癌細胞株中，LSD1表達量最高且差異有統計學意義(P<0.01)，只有KDM5A和KDM5B在HO8910中低表達(圖1a)。蛋白水平表達分析發現，LSD1在3種卵巢癌細胞中均高表達；KDM5A在SKOV- 3和HO89104中高表達，在3AO細胞中低表達，KDM5C在3AO中低表達(圖1b)。KDM5D只在雄性特異表達[17]。

2.2LSD1在正常卵巢上皮細胞和癌細胞中的表達

我們進一步應用蛋白質印跡法檢測了LSD1在正常卵巢上皮細胞中的表達，結果表明，與正常卵巢上皮細胞系(HOSEpiC)比較，LSD1在卵巢癌細胞中的表達異常增高(圖1c)。

a.LSD1和KDM5家族在SKOV- 3、HO8910、3AO中的RT- PCR分析;b.LSD1和KDM5家族在3種卵巢癌細胞中的蛋白質印跡檢測；c.LSD1在3種卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞的蛋白質印跡對比檢測

圖1LSD1和KDM5家族在SKOV- 3、HO8910、3AO和HOSEpiC中的表達

a.mRNA expression of LSD1 and KDM5 members within SKOV- 3，HO8910，3AO by RT- PCR；b.Protein expression of LSD1 and KDM5 members within these 3 ovarian cancer cell lines by Western blot； c.Comparative protein expression of LSD1 between normal ovary epithelium cells and 3 ovarian cancer cell lines by Western blot

Fig 1Expression of LSD1 and KDM5 members within SKOV- 3，HO8910，3AO and HOSEpiC cell lines

2.3 LSD1對卵巢癌細胞增殖的影響

MTT法檢測發現，LSD1的特異性抑制劑TCP(500μmol·L-1)處理卵巢癌細胞24 h后能顯著抑制癌細胞的增殖(P<0.05)(圖2)，進一步驗證了LSD1與卵巢癌的發生發展有密切關系。

圖2MTT檢測不同濃度TCP處理24 h后SKOV- 3、HO8910和3AO細胞的增殖

Fig 2SKOV- 3，HO8910 and 3AO were treated with various concentration of TCP for 24 h，and cell viability was assessed by MTT assay

2.4LSD1對卵巢癌細胞遷移的影響

另一方面，通過劃痕實驗觀察了TCP(500μmol·L-1)對卵巢癌細胞遷移的影響，發現與對照組相比，TCP處理組細胞遷移率顯著小于正常組(P<0.05)(圖3)，提示LSD1促進了卵巢癌細胞的遷移。

圖3TCP處理不同時間后SKOV- 3和HO8910細胞的遷移

注：柱狀圖表示TCP處理0、6、12、24 h后刮痕區的遷移率；數據由3次實驗取平均數和標準差

Fig 3Microphotographs show the migration rate of wounded area(Data are presented as means±SD from 3 independent experiments)

3討論

多個研究表明LSD1在卵巢癌細胞中高表達[6，18]，我們的結果與其是一致的；我們先前研究[6]發現LSD1在翻譯水平也存在著調控，表明分析LSD1在蛋白水平的表達也有著重要的研究價值。

有研究[19]發現，KDM5A可以顯著(>100倍)影響腫瘤細胞對藥物的敏感性。本實驗結果表明，KDM5A在SKOV- 3、HO8910中均高表達，在3AO中表達較弱。Wang等[20]發現在上皮卵巢癌細胞中KDM5B表達顯著增加，KDM5B表達水平與化療抗藥性和病人5年存活率之間存在著顯著相關；而本實驗中KDM5B在3種卵巢癌細胞系中均呈低表達，這可能是由于我們采用的3種卵巢囊腺瘤細胞系，KDM5B在不同類型的卵巢癌中表達不同，但仍需進一步證實。Wang等[9]研究表明，KDM5C(JARID1C)可以促進乳腺癌細胞的轉移和侵襲；本實驗中只有3AO細胞系存在著KDM5C的弱表達，該酶對不同卵巢癌的轉移和侵襲能力也具有一定的研究價值。KDM5D(JARID1D)位于Y染色體，只在雄性特異表達[17]；本研究也從mRNA表達水平證實卵巢癌細胞中不存在該基因的表達。

TCP是目前研究中普遍采用的LSD1特異性抑制劑，它可以抑制LSD1的pK4去甲基化活性[21]。TCP抑制LSD1活性后發現卵巢癌細胞的增殖受到明顯抑制，這表明LSD1能明顯促進人卵巢癌細胞增殖。同樣處理后發現卵巢癌細胞的遷移也受到抑制，這表明LSD1可能參與了遷移過程。這些結果與其他利用不同卵巢樣品或細胞系所做出的實驗結論[18]是一致的。目前，已經有抑制KDM5A、KDM5B活性的化合物處于前期研究階段[1]，但相應的特異抑制劑以及KDM5C、KDM5D的抑制劑還未有報道，LSD1和KDM5家族特異抑制劑的研發、對抗癌藥物篩選及其在卵巢癌中的作用機制研究都有著醫學和科學價值。

綜上所述，LSD1和KDM5家族成員與人卵巢癌的發生發展密切相關。LSD1不僅能促進人卵巢癌細胞增殖，同時能顯著提高人卵巢癌細胞的遷移能力。LSD1和KDM5家族成員抑制劑有望成為篩選抗癌藥物的新方向。

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The expression of LSD1 and KDM5 and the effects of LSD1 on proliferation and migration in ovarian cancer cells

JIA Chao1，2，WANG Jie3，SHAO Gen- bao3，LU Zu- hong1

(1.StateKeyLaboratoryofBioelectronics，SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering，SoutheastUniversity，Nanjing210096，China； 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China； 3.SchoolofBasicMedicineandMedicalTechnology，JiangsuUniversity，Zhenjiang212013，China)

[Abstract]Objective： To investigate the expression of lysine- specific demethylase 1(LSD1) and lysine demethylase 5 (KDM5)，as well as the role of LSD1 on proliferation and migration within human ovarian cancer cells. Methods: Relative mRNA and protein levels of LSD1，KDM5A，KDM5B，KDM5C，KDM5D were detected respectively by real- time quantitative and Western blot in SKOV- 3，HO8910，3AO cells. The expressions of LSD1 were comparatively analyzed between a human ovarian epithelial cell line and three ovarian cancer cell lines by Western blot. In addition， the effects of LSD1 on proliferation and migration were determinted by MTT and wound- healing assay respectively. Results: The expression of LSD1 was highest(P<0.01)，and the expression of KDM5 members was different in these ovarian cancer cells. Tranylcypromine， the inhibitor of LSD1， significantly decreased the proliferation and migration(P<0.05). Conclusion: LSD1 expresse at high level and the member of KDM5 family expresse at differentiated level within 3 ovarian cancer cell lines， and LSD1 is significantly correlated with the proliferation and migration within these 3 ovarian cancer cell lines．

[Key words]lysine- specific demethylase 1； ovarian cancer； cell proliferation； cell migration

[收稿日期]2016- 02- 27[修回日期] 2016- 03- 20

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(61227803，81170573)；南京農業大學青年基金資助項目(060J2063)

[作者簡介]

賈超(1980-)，男，安徽亳州人，講師，在讀博士研究生。E- mail:jiachao@njau.edu.cn

[通信作者]陸祖宏E- mail:zhlu@seu.edu.cn；邵根寶E- mail:gbshao07@ujs.edu.cn

[中圖分類號]R737.31； R73- 3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0350- 05

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03.013

[引文格式] 賈超,王潔,邵根寶,等.LSD1和KDM5家族在卵巢癌細胞中的表達及LSD1對細胞增殖遷移的影響 [J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):350- 354.

·論著·