白芍總苷對大鼠急性胰腺炎炎性反應及PKD1、NF-κB蛋白表達的影響研究

陳慧永，孫　超，沈捷雯，索林格

(上海黃浦區中西醫結合醫院，上海 200010)

白芍總苷對大鼠急性胰腺炎炎性反應及PKD1、NF-κB蛋白表達的影響研究

陳慧永，孫超，沈捷雯，索林格

(上海黃浦區中西醫結合醫院，上海 200010)

[摘要]目的探討白芍總苷對大鼠急性胰腺炎炎性反應及PKD1、NF-κB蛋白表達的影響。方法將72只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、白芍總苷20 mg/kg組、白芍總苷40 mg/kg組、白芍總苷60 mg/kg組、甲磺酸加貝酯10 mg/kg組，每組12只。除空白組外，其余組大鼠均采用逆行胰膽管注入 3.5%?；悄懰徕c并保留1 min的方法建立急性胰腺炎大鼠模型。空白組、模型組均給予生理鹽水尾靜脈注射，各給藥組給予相應劑量的藥物尾靜脈注射。干預12 h后取血檢測血清淀粉酶(AMY)、TNF-α、IL-6、IL-8水平；干預24 h后處死大鼠記錄大鼠胰腺濕質量、腹水量，鏡下觀察胰腺組織病理改變，采用 Western-blot 方法檢測胰腺組織中 PKD1、 NF-κB 表達水平。結果模型組血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平及胰腺濕質量、腹水量均顯著高于空白組(P均<0.05)，各給藥組血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平，胰腺濕質量與腹水量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且白芍總苷各劑量組各指標水平呈劑量依賴性降低(P均<0.05)。模型組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯高于空白組(P均<0.05)，各給藥組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，白芍總苷60 mg/kg組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯低于其他給藥組(P均<0.05)。結論白芍總苷可顯著抑制急性胰腺炎大鼠炎癥反應，可能與其降低PKD1、NF-κB蛋白表達有關。

[關鍵詞]急性胰腺炎；白芍總苷；炎癥因子；蛋白激酶

急性胰腺炎(AP)是臨床上發病率較高、危害患者生命的急腹癥之一。該病主要表現為局部或全身性炎癥反應及胰腺組織的改變，預后不良，病死率10%～20%[1]。目前急性胰腺炎的發病機制尚不明確，但認為與炎癥反應、胰腺泡內鈣超載、自噬凋亡等密切相關[2]。白芍總苷(TGP)是從中藥白芍藥根中提取的有效成分，主要含芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內酯苷及苯甲酰芍藥苷等，具有調節細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)等作用，因此具有廣泛的抗炎作用[3]。我院前期驗證性采用白芍總苷治療急性胰腺炎患者取得了良好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。故本研究觀察了白芍總苷對大鼠急性胰腺炎炎性反應及PKD1、NF-κB蛋白表達的影響，旨在探討該藥的作用機制。

1實驗資料

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠，體質量 200～250 g，SPF 級，由上海第二軍醫大學動物實驗室提供，許可證號：SCXK (軍)2014-0144。實驗室室溫(23±2)℃，相對濕度 40%～70%。適應性飼養1周，喂以常規實驗室飼料。實驗前12 h 起禁食，不控制飲水。

1.2藥物和試劑苯巴比妥(上海第二軍醫大學實驗室配制)；?；悄懰徕c(美國Sigma 公司)；0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業有限公司)；10%中性緩沖福爾馬林固定液(上海天威醫藥化工有限公司)；IL-6、TNF-α放射免疫試劑盒(南京建成有限公司)。鼠抗人PKD多克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體，鼠抗人p65NF-κB抗體，羊抗鼠p65NF-κB二抗，羊抗鼠PKD二抗(美國ABZOOM公司)。蘇木素-伊紅溶液(第二軍醫大學實驗室配制)，注射用甲磺酸加貝酯(常州四藥制藥有限公司)，白芍總苷(華潤三九醫藥有限公司，批號：20152247，純度93.7%)。

1.3實驗方法將72只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、白芍總苷20 mg/kg組、白芍總苷40 mg/kg組、白芍總苷60 mg/kg組、甲磺酸加貝酯10 mg/kg組，每組12只。除空白組外，其余組大鼠均參照文獻[4]方法造模：腹腔注射苯巴比妥后劍突下正中2 cm切口開腹，充分暴露十二指腸及其系膜內的膽胰管，夾閉膽胰管，一次性靜脈留置套管針，套管針插入膽胰管約1.0 cm，立即將濃度3.5%的牛磺膽酸鈉以0.1 mL/min的速度注射入胰膽管，給藥量為 1.0 mL/kg，然后閉合胰膽管近乳頭處，在無菌環境中縫合腹腔。造模后空白組、模型組均給予生理鹽水尾靜脈注射，各給藥組給予相應劑量的藥物尾靜脈注射。干預12 h后取各組大鼠靜脈血1 mL測定血清淀粉酶(AMY)及TNF-α、IL-6、 IL-8水平。干預24 h后處死大鼠，記錄腹水量，分離胰腺組織并稱質量，然后固定于 10%福爾馬林液中，石蠟包埋，5 μm 連續切片，取胰頭部位組織行HE染色，光鏡下觀察胰腺的病理組織學改變，同時采用Western-blot法檢測胰腺組織中PKD1、NF-κB表達情況。

2結果

2.1各組動物死亡情況空白組無大鼠死亡；造模12 h后模型組死亡3只, 白芍總苷20 mg/kg組死亡2只，其余組均未發生死亡。

2.2各組大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8 水平模型組血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平均顯著高于空白組(P均<0.05)，提示造模成功。各給藥組血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且白芍總苷各劑量組各指標水平呈劑量依賴性降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8 水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與白芍總苷20 mg/kg組比較，P<0.05；④與白芍總苷40 mg/kg組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠胰腺濕質量及腹水量模型組胰腺濕質量與腹水量均顯著高于空白組(P均<0.05)，提示造模成功。各給藥組胰腺濕質量與腹水量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且白芍總苷各劑量組胰腺濕質量與腹水量呈劑量依賴性降低(P均<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠胰腺組織病理學表現空白組胰島形態、數目正常，胰腺細胞形態輪廓正常，細胞膜、胞漿、核均較為清晰，未見炎癥細胞浸潤，見圖1。模型組可見大部分胰腺細胞破裂，正常胰腺數目極少，大量腺泡壞死崩解，結構紊亂，核固縮、壞死，大量中性粒細胞浸潤，見圖2。甲磺酸加貝酯10 mg/kg組胰腺細胞形態、數目不正常，胰泡細胞部分排列較為紊亂，炎癥細胞浸潤，但浸潤程度低于模型組，部分胰腺細胞核固縮、壞死，見圖3。白芍總苷20 mg/kg組胰腺細胞炎癥浸潤、壞死程度、數量形態等與模型組相似，見圖4。白芍總苷40 mg/kg組胰腺細胞壞死程度較20 mg/kg組明顯減輕，炎癥浸潤、細胞形態與甲磺酸加貝酯10 mg/kg組相似，見圖5。白芍總苷60 mg/kg組炎癥浸潤、細胞壞死程度明顯輕于40 mg/kg組及甲磺酸加貝酯10mg/kg組，細胞形態部分正常。見圖6。

表2　各組大鼠胰腺濕質量及腹水量比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與白芍總苷20 mg/kg組比較，P<0.05；④與白芍總苷40 mg/kg組比較，P<0.05。

圖1　空白組大鼠胰腺組織病理表現

圖2　模型組大鼠胰腺組織病理表現

圖3　甲磺酸加貝酯10 mg/kg組大鼠胰腺組織病理表現

圖4　白芍總苷20 mg/kg組大鼠胰腺組織病理表現

圖5　白芍總苷40 mg/kg組大鼠胰腺組織病理表現

圖6　白芍總苷60 mg/kg組大鼠胰腺組織病理表現

2.5各組大鼠胰腺組織中PKD1、NF-κB表達情況模型組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。各給藥組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，白芍總苷60 mg/kg組PKD1、NF-κB蛋白表達水平均明顯低于其他給藥組(P<0.05)。見表3。

3討論

急性胰腺炎是由多種因素引起胰酶激活導致胰腺炎癥反應，伴或不伴有其他器官功能改變的疾病[4]。急性胰腺炎發生、發展過程中產生一系列炎癥遞質，導致炎癥的“瀑布樣級聯反應”，使病情進行性加劇，如不及時治療，最終引發SIRS和MODS而導致死亡[4-6]。IL-6、IL-8、TNF-α被證實在胰腺炎發作后迅速增加，是導致胰腺炎患者死亡的高危因素[7]。介導胰腺炎癥反應的重要信號分子包括PKD1和NF-κB，TNF-α、IL-1β、IL-2、COX2、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等多種參與早期炎癥反應和免疫反應的因子都受二者調控[8-14]。PKD是一種具有3個亞型的新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白質，分別為PKD1、PKD2、PKD3，尤其是PKD1/PKD2 在機體天然免疫應答過程中起著重要作用，其中PKD1可作為NF-κB的下游蛋白，參與炎癥反應的發生[13-14]。NF-κB信號通路亦被多項研究證實在胰腺炎炎癥反應中扮演重要的角色，是細胞信號傳遞的重要因子，是免疫、炎癥、應激、機體防疫、組織損傷、凋亡等多種反應的參與因子[13]。在感染、損傷刺激下，上游信號將誘使NF-κB 活化，而活化的NF-κB 將啟動多種基因的轉錄，如炎癥因子，這將加速炎癥因子的表達，而炎癥因子又可進一步刺激NF-κB 活化，兩者形成爆發式的連鎖反應，最終誘使局部組織炎癥反應，導致組織壞死[15-16]。

表3　各組大鼠胰腺組織中PKD1、NF-κB表達情況

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與白芍總苷60 mg/kg組比較，P<0.05；④與甲磺酸加貝酯10 mg/kg組比較，P<0.05。

白芍總苷是白芍的主要有效成分，其具有多途徑抑制炎癥反應、拮抗氧化應激反應等作用，主要用于類風濕關節炎、干燥綜合征和系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療[17-19]，其用于急性胰腺炎的治療報道較少。本研究結果顯示，在造模后12 h，血清促炎性細胞因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯升高；給予白芍總苷干預后，各指標水平均明顯低于模型組，并呈現劑量依賴性。說明白芍總苷可顯著抑制急性胰腺炎所致的炎癥反應。胰腺一般狀態及病理研究顯示，白芍總苷60 mg/kg組胰腺濕質量與腹水量均明顯低于模型組，胰腺細胞炎癥浸潤程度和細胞壞死程度輕，進一步說明白芍總苷可抑制胰腺組織內炎癥反應的進展。Western-blot結果顯示模型組PKD1、NF-κB蛋白表達過高，白芍總苷干預后PKD1、NF-κB蛋白表達水平明顯降低，提示白芍總苷可抑制急性胰腺炎大鼠炎癥反應，減輕胰腺組織損傷。

綜上所述，白芍總苷可顯著抑制胰腺炎炎癥反應，減輕炎癥所致的胰腺損傷，可能與其降低PKD1、 NF-κB蛋白表達有關。

[參考文獻]

[1]孫沛，盧國良，林莊，等. 急性胰腺炎的治療新進展[J]. 中國藥業，2011，20(15)：86-88

[2]王宇. 重癥急性胰腺炎的治療進展[J]. 中國藥業，2009，18(23)：63-64

[3]鄧兆智，鐘秋生. 白芍總苷的藥理與臨床研究考釋[J]. 實用中醫內科雜志，2004，18(3)：181-184

[4]中華醫學會消化病學分會胰腺疾病學組. 中國急性胰腺炎診治指南[J]. 中國實用內科雜志，2013，33(7)：530-535

[5]van Brunschot S，Schut AJ，Bouwense SA，et al. Abdominal compartment syndrome in acute pancreatitis：a systematic review[J]. Pancreas，2014，43(5)：665-674

[6]周振華. 蛋白激酶D1在大鼠急性胰腺炎中作用機制的實驗研究[D]. 衡陽：南華大學，2014：23-46

[7]Kuo MY，Liao MF，Chen FL，et al. Luteolin attenuates the pulmonary inflammatory response involves abilities of antioxidation and inhibition of MAPK and NFκB pathways in mice with endotoxin-induced acute lung injury[J]. Food Chem Toxicol，2011，49(10):2660-2666

[8]朱杰,樸榮利,高潤平. TLR4信號傳導通路與胰腺炎[J]. 世界華人消化雜志，2012，20(4): 271-275

[9]王冬，李勇，范立僑，等. 大鼠重癥急性胰腺炎肝損傷經胸導管引流干預時NF-κB、IL-6、TNF-α的表達及意義[J]. 河北醫科大學學報，2010，21(8):905-908

[10] 朱杰. 可溶性IL-2受體，一種新的自身免疫性胰腺炎(AIP)標記物[J]. 臨床肝膽病雜志，2012，28(4):295

[11] 李春生，蔡雷，王銀平，等. COX-2在重癥急性胰腺炎所致肝臟損傷中的作用[J]. 中國普外基礎與臨床雜志，2010，17(4):343-347

[12] 張弘，許可銀，周國雄，等. 趨化因子Fractalkine 在大鼠重癥急性胰腺炎中的作用及烏司他丁的干預效應[J]. 中國病理生理雜志，2011，27(11) :2180-2184

[13] 楊雷，毛秉豫，徐國昌，等. 黃芪提取物對大鼠心肌梗死后心肌組織PKD1蛋白表達的影響[J]. 中國藥理學通報，2013，29(4)：535-539

[14] Goodall MH，Wardlow RD，Goldblum RR，et al． Novel function of cardiac protein kinase D1 as a dynamic regulator of Ca2+sensitivity of contraction[J]. J Biol Chem，2010，285(53)：686-700

[15] 牛曉璐，許萬福，李松玉，等. 蛋白激酶D1在煙曲霉介導的NF-κB信號通路激活及轉錄活性中的作用[J]. 南方醫科大學學報，2013，33(3)：351-355

[16] 李祥,羅閎丹,石青,等. 小鼠侵襲性肺曲霉病發病過程中TLRs/NF-κB信號通路的激活[J]. 中國免疫學雜志,2010,26(10)：881-884

[17] 林志茂. 白芍總苷在風濕免疫性疾病中的臨床應用[J/CD]. 世界最新醫學信息文摘：電子版,2013,13(20):273

[18] 肖堃. 白芍總苷在自身免疫性疾病中的應用[J]. 中華臨床免疫和變態反應雜志，2008，2(1)：55-60

[19] 章懿婷,陳志偉,武劍,等. 白芍總苷治療干燥綜合征26例[J]. 世界中醫藥,2012,7(2):124-125

Study on effects of total peony glucosides on inflammatory reaction and expression of PKD1 and NF-κB in acute pancreatitis rats

CHEN Huiyong， SUN Chao, SHEN Jiewen, SUO Linge

(Huangpu Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai 200010, China)

Abstract:Objective It is to explore the effects of total peony glucosides (TPG) on inflammatory reaction and expression of PKD1 and NF-κB in acute pancreatitis (AP)rats. Methods 72 SD rats were randomly divided into blank group, model group, 20 mg/kg TPG group, 40 mg/kg TPG group,60 mg/kg TPG group,10 mg/kg gabexate mesylate group, each group had 12 rats. All the rats except in blank group were used to establish AP models by retrograde cholangiopancreatography injection of 3.5% sodium taurocholate and retention method 1 min. Blank group and model group were given normal saline by tail vein injection, and the other 4 groups were given respective drugs bye the same method. The levels of blood NF-α, IL-6, IL-8 were determined after intervention for 12 h, after 24 h, the rats were killed to measure pancreas wet weight，ascites were recorded and pathological changes of pancreas tissue were observed, PKD1, NF-κB expression were detected by Western-blot method besides. Results The levels of serum AMY, NF-α, IL-6, IL-8 and pancreas wet weight，ascites in model group were all higher than that in blank group (P all<0.05), and these indexes in every treatment group were lower than that in model group (P all<0.05), the decreasing showed a dose dependence in every TPG groups (P<0.05). The expression level of PKD1 and NF-κB in model group were higher than that in blank group (P<0.05), but the expression levels were lower in every treatment group than that in model group (P<0.05), the levels in 40 mg/kg TPG group and 60 mg/kg TPG group were lower than that in the other treatment groups (P<0.05). Conclusion TGP can alleviate the inflammatory response and pancreatic necrosis. The mechanism may be related with the inhibition of expression of PKD1 and NF-κB.

Key words：acute pancreatitis； total peony glucosides;inflammatory cytokines; protein kinase

[作者簡介]陳慧永,男,副主任醫師，主要從事普外科臨床診治工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.002

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)10-1030-04

[收稿日期]2015-10-17