接種尖鐮孢菌對枸杞苯丙烷代謝關鍵酶及產物的影響

李捷，馮麗丹，楊成德，王有科，何靜，張寶琳，陳秀蓉*（.甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070；.甘肅省林業科學研究院，甘肅 蘭州 73000）

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接種尖鐮孢菌對枸杞苯丙烷代謝關鍵酶及產物的影響

李捷1，馮麗丹1，楊成德1，王有科1，何靜1，張寶琳2，陳秀蓉1*
（1.甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省林業科學研究院，甘肅 蘭州 730020）

為了闡明抗感枸杞與根腐病病原菌互作過程中苯丙烷代謝途徑中關鍵酶和代謝產物的變化差異與抗病性的關系，以枸杞栽培品種寧杞一號（NingqiⅠ）、寧杞二號（NingqiⅡ），國內野生種中國枸杞、寧夏枸杞，美洲引進野生種L.brevipes、L.exsertum等6種材料為參試材料，采用切根法接種強致病菌尖鐮孢菌后統計死亡率，以此篩選出抗病和感病材料，并測定二者0～20 d內苯丙氨酸解氨酶（P A L）、肉桂酸羥化酶（C4 H）、4-香豆酰-輔酶A連接酶（4 C L）等苯丙烷代謝途徑關鍵酶以及總酚和類黃酮等代謝產物的動態變化。結果表明，6種參試材料接種枸杞根腐病強致病菌尖鐮孢菌后，野生材料較栽培材料抗病性強，寧杞一號為感病材料，L.exsertum抗根腐病能力最強；抗病材料L.exsertum苯丙烷代謝關鍵酶苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酰-輔酶A連接酶活性顯著高于寧杞一號，初步確定苯丙烷代謝中的苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酰-輔酶A連接酶的活性和類黃酮的含量與枸杞材料抗根腐病呈正相關。因此，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4-香豆酰-輔酶A連接酶活性和類黃酮含量，初步可以作為篩選抗枸杞尖鐮孢菌根腐病的生化指標。

枸杞；根腐病；尖鐮孢菌；苯丙烷代謝；抗病性

http://cyxb.lzu.edu.cn

李捷，馮麗丹，楊成德，王有科，何靜，張寶琳，陳秀蓉.接種尖鐮孢菌對枸杞苯丙烷代謝關鍵酶及產物的影響.草業學報，2016，25（5）：87-94.

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枸杞（Lycium barbarum）為茄科多年生落葉灌木，是重要的“藥食同源”型植物資源之一，是干旱荒漠區的牧草資源［1］，具有抗衰老［2］、抗氧化［3］、免疫調節［4］及生殖系統［5］等重要功能，是中國西北地區的特色經濟林，業已成為農村重要的經濟來源。但1980年枸杞根腐病在西寧市省軍區園藝場成片發生，在柴達木盆地的香日德農場的發病率一度高達53.2%［6］；1989年枸杞根腐病在寧夏普遍發生，最重的病株37.6%，枯死株26.5%，平均病株15%，枯死株5%［7］；1998年新疆主要枸杞栽培區有些地塊栽植當年就開始死亡，一般地塊栽植2～3年后死亡率為20%～30%，重者全田被毀［8］。根據本研究小組2012－2013年對甘肅枸杞主產區根腐病調查顯示：平均發病率為20.6%，最嚴重地塊高達72.4%，已經嚴重影響到了該產業的可持續發展。因此尋找抗枸杞根腐病的種質資源并研究它們的抗病生理機制顯得尤為重要。關于植物的抗病性與其苯丙烷代謝具有密切的相關性已有不少報道。高必達和陳捷［9］認為，植物的防御反應與苯丙烷代謝途徑的中間代謝產物及終產物有密切的關系；包改紅等［10］研究證明抗病品種“青薯168”接種硫色鐮孢菌（Fusarium sulphureum）后，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶和4-香豆酰-輔酶A連接酶活性以及總酚、類黃酮和木質素含量均顯著高于感病的“隴薯3號”，苯丙烷代謝在馬鈴薯（Solanum tuberosum）塊莖抗干腐病方面具有重要的作用；馬靜芳等［11］認為苜蓿（Medicagosativa）接種尖鐮孢菌（Fusarium oxysporum）抗性品種的苯丙氨酸解氨酶活性顯著高于感病品種，其活性與苜蓿抗病性有重要的關系；宋修鵬等［12］證實了甘蔗（Saccharum officinarum）苯丙氨酸解氨酶基因（ScP AL）參與了抗黑穗病過程。而枸杞接種尖鐮孢菌（F.oxysporum）后對苯丙烷代謝中關鍵酶和產物的影響尚未見研究報道。本研究擬選用6個枸杞材料，接種強致病菌尖鐮孢菌確定其抗感材料，再進一步選擇具有代表性的抗、感枸杞材料各1個，研究苯丙烷代謝中關鍵酶活性的變化趨勢和主要代謝產物的積累情況，以期為西北地區選育抗枸杞根腐病材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枸杞：選育自野生種寧夏枸杞（L.barbarum）的主栽品種寧杞一號、寧杞二號，野生種中國枸杞（L.chinense）、野生種寧夏枸杞，引自美國的枸杞屬野生種L.brevipes、L.exsertum共6種材料（表1）。6種材料于2014年在甘肅農業大學林學院森林培育實驗室進行組織培養煉苗，移栽至13 c m×12 c m營養缽中，以泥炭∶蛭石（V∶V）＝1∶1滅菌后為培養基質，每盆移栽3株，成活后僅保留1株生長最好的繼續培養。每周澆灌一次滅菌M S營養液，期間補充無菌水以保持土壤濕潤，苗木生長至20 cm 左右時，選生長健壯均一苗木若干進行試驗。

病原菌：尖鐮孢菌，采自甘肅省靖遠縣枸杞產區根腐病發病植株。在接種前7 d于馬鈴薯瓊脂培養基（P D A）上活化備用。

主要儀器與試劑：Shim adzu U V2450紫外可見分光光度計、T herm o F R ESC O17低溫高速離心機等。試驗采用的所有試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 6種材料抗病性比較 接種方法：本試驗于2014年在甘肅農業大學森林培育實驗中心進行。取長至滿皿的尖鐮孢菌加無菌水制成濃度為106個/m L菌懸液。采取傷根后灌根的方法接種。具體做法如下：先用鋒利的刀具在距離苗木2 c m處垂直向下切斷根系至盆底，苗木的4個方向各切一刀，確保切斷一定數量的根系，若未切斷根系可將斷根位置稍往苗木方向平移。然后將配制好備用的菌懸液每盆澆灌20 m L，每處理接種10盆，以切根澆灌無菌水20 m L為對照；每處理均重復3次。接種后覆膜、插上編號標簽，黑暗培養24 h后正常光照培養，7 d后去膜，澆灌無菌水保持土壤濕潤。

觀測及統計方法：接種后，觀察6種枸杞的發病情況，20 d時調查發病情況。以莖基部上出現褐色病斑，根系及維管束變黑，植株地上部落葉90%以上作為根腐病典型特征［13］，調查死亡率并比較各材料的抗病性。

死亡率（%）＝（發病死亡株數－對照死亡數）/（接種總株數－對照死亡數）×100

1.2.2 苯丙烷代謝途徑相關指標樣品處理及采樣 選感、抗枸杞各1種，按照1.2.1的方法接種尖鐮孢菌。接種后立即采樣一次，然后每4 d的14：00定時采樣1次，采集植株中上部完全展開的葉片，每株采集2～3片，做成混合樣6份，每份0.2 g，用錫箔紙包好，液氮冷凍后放入－80℃低溫冰箱內保存備用；采0～20 d的樣品，共6次。

1.2.3 苯丙氨酸解氨酶（P A L）活性測定 參照李合生等［14］和Liu等［15］的方法，提取液和測定體系隨樣品重量減量。

1.2.4 肉桂酸羥化酶（C4 H）活性測定 參照范存斐等［16］以及La m b和Rubery［17］的方法，提取液和測定體系隨樣品重量減量。

1.2.5 4-香豆酰-輔酶A連接酶（4 C L）活性測定 參照范存斐等［16］與朱明華等［18］的方法，提取液和測定體系隨樣品重量減量。

1.2.6 總酚、類黃酮含量測定 參照Pirie和M ullins［19］的方法，提取液和測定體系隨樣品重量減量。

1.3 數據統計

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0數據處理系統進行數據統計處理。應用SPSS 19.0對數據進行單因素方差分析（O ne-way A N O V A），并利用Duncan’s多重比較對差異進行顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 6種材料對根腐病病原菌抗性比較

表1結果顯示，6種材料接種尖鐮孢菌后，第20天寧杞一號、寧杞二號、中國枸杞、寧夏枸杞、L.brevipes和L.exsertum死亡率分別為89.3%，78.6%，75.9%，71.4%，51.7%和13.8%。O ne-way A N O V A結果表明，寧杞一號死亡率顯著高于其余枸杞（P＜0.05），而L.exsertum接種后死亡率顯著低于其余枸杞（P＜0.05）；野生種枸杞死亡率略低于栽培種枸杞；引進野生種枸杞死亡率均較低。結果顯示寧杞一號為感病品種；而L.exsertum對尖鐮孢菌引起的枸杞根腐病具有良好的抗性。因此選擇寧杞一號和L.exsertum為感病、抗病材料進行苯丙烷代謝相關指標的研究。

表1 6種枸杞接種尖鐮孢菌死亡率Table 1 The death rate of 6 Lyciums by inoculation F.oxysporum

2.2 尖鐮孢菌對抗感材料苯丙氨酸解氨酶（P A L）、肉桂酸羥化酶（C4 H）及4-香豆酰-輔酶A連接酶（4 C L）活性的影響

圖1表明，寧杞一號對照、寧杞一號接種、L.exsertum對照和L.exsertum接種在0～20 d內P A L活性均呈現出降－升－降的變化趨勢，L.exsertum起始活性更高。寧杞一號對照和L.exsertum對照在0～20 d內波動微小，組內差異不顯著（P＝0.059和0.361）；而寧杞一號接種和L.exsertum接種組變化比較劇烈。寧杞一號接種組P A L活性先大幅下降后大幅上升并在第8天超過L.exsertum接種組，最后迅速下降至最低水平，表明在第8天時雖然P A L活性被激發了，但其酶活持續時間很短。L.exsertum接種組P A L活性小幅下降后迅速上升，在第20天達到所有組別最高值81.49 U/（g F W·min）。試驗表明，L.exsertum在0～20 d內P A L活性顯著高于寧杞一號（P＜0.05），且接種尖鐮孢菌后可顯著提高其體內P A L的活性（P＜0.05）。

在圖2中4組試驗材料在0～20 d內C4 H活性均呈現出先升后降的變化趨勢。寧杞一號對照、寧杞一號接種和L.exsertum對照組在整個過程中組間差異不顯著，但是L.exsertum接種組下降幅度顯著小于其余3個組別，其達到了均值4.376 U/（g F W·min），顯著高于起始值（1.415 U/g F W·min）。試驗表明，L.exsertum在接種尖鐮孢菌后0～20 d內可顯著激發其體內C4 H的活性（P＜0.05）。

圖1 接種尖鐮孢菌枸杞P A L活性的變化Fig.1 The changes of phenylalanine am monialyase activity after inoculation F.oxysporum

圖2 接種尖鐮孢菌枸杞C4 H活性的變化Fig.2 The changes of trans-cinnamic acid-4-hydroxylase activity after inoculation F.oxysporum

在圖3中，4組試驗材料均出現了4 C L活性先升后降的變化趨勢。寧杞一號對照、寧杞一號接種和L.exsertum對照組在0～20 d中差異不顯著，但是L.exsertum接種組的4 C L在第8天后保持了較高的活性。L.exsertum接種組第0天活性為0.354 U/（g F W·min），而20 d內均值為6.937 U/（g F W·min），上升了19.6倍。試驗表明，L.exsertum在接種尖鐮孢菌后0～20 d內可顯著激發其體內4 C L的活性（P＜0.05）。

2.3 尖鐮孢菌對抗感材料總酚和類黃酮含量的影響

如圖4所示，4組試驗材料在0～20 d內總酚含量均出現了先升后降的變化趨勢。寧杞一號對照、寧杞一號接種組間和L.exsertum對照與L.exsertum接種組間總酚含量差異不顯著，寧杞一號接種與L.exsertum接種組間差異也不顯著。寧杞一號總酚含量整體高于L.exsertum。試驗結果表明，在接種尖鐮孢菌后各參試材料中總酚含量0～20 d內沒有顯著地積累，各材料中總酚含量與其抗病性的相關性不大。

圖3 接種尖鐮孢菌枸杞4CL活性的變化Fig.3 The changes of 4-cou marate：coenzyme A ligase activity after inoculation F.oxysporum

圖4 接種尖鐮孢菌枸杞總酚含量的變化Fig.4 The changes of total phenolics contents after inoculation F.oxysporum

如圖5所示，寧杞一號對照、寧杞一號接種與L.exsertum對照在0～20 d內類黃酮含量均出現了先升后降的變化趨勢，而L.exsertum接種組則是先上升而后穩定在較高水平。寧杞一號對照和寧杞一號接種組在0～20 d內出現了較大幅度的波動，峰值均在第4天，分別為825.44和666.17 O D325/g F W，但是到第20天時均未出現類黃酮的積累，反而略低于第0天。L.exsertum對照組一直在第0天含量水平波動，整個過程無顯著差異（P＞0.05）。L.exsertum接種組第8天之后顯著高于其余組別（P＜0.05）。試驗表明，L.exsertum的抗病性可能與類黃酮的積累呈正相關。

圖5 接種尖鐮孢菌枸杞類黃酮含量的變化Fig.5 The changes of flavonoids contents after inoculation F.oxysporum

3 討論

3.1 6種材料對根腐病病原菌抗性表現

6種材料接種尖鐮孢菌后對照株中有個別植株死亡，其原因可能是切根時對根系具有一定的損傷造成；當接種尖鐮孢菌后L.exsertum死亡率僅為13.8%，為參試材料中死亡率最低，顯著低于寧杞一號的89.3%（表1）。研究表明L.exsertum在6種參試材料中抗根腐病能力最強，且野生種材料的抗病性略高于栽培品種枸杞，在分子育種的過程中可以加以利用。

3.2 苯丙氨酸解氨酶（P A L）、肉桂酸羥化酶（C4 H）及4-香豆酰-輔酶A連接酶（4 C L）等苯丙烷代謝關鍵酶在抗枸杞根腐病中的作用

苯丙氨酸解氨酶（P A L）是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶，參與了多種激發子誘導的抗性［20］，增強了植物對病原侵染的抵抗能力［21］。徐凌飛等［22］認為P A L的活性變化與梨品種抗病性呈正相關，李曉敏等［23］的研究顯示大蒜（Allium sativum）抗病品種P A L活性的最大峰值高于感病品種，薛軍等［24］通過苦蕎（Fagopyrum tataricum）苯丙氨酸解氨酶基因（FtP AL）的研究認為P A L在苦蕎抗病過程中有重要作用，劉瑞峰等［25］對早期差異表達基因分析發現苯丙烷代謝途徑在月季（Rosa chinensis）抵抗黑斑病菌過程中發揮重要作用。在本研究中接種尖鐮孢菌后抗病材料L.exsertum P A L活性顯著高于感病的寧杞一號，且接種尖鐮孢菌后可顯著提高其體內P A L的活性，這與前人在黃瓜（Cucumissativus）［26］和甘薯（Dioscoreaesculenta）［27］上的研究結果類似。

C4 H作為苯丙烷代謝途徑上P A L之后的又一關鍵酶［28］，以肉桂酸為前體催化合成ρ-香豆酸，這是咖啡酸和阿魏酸等物質的前體。C4 H活性的增強可以增加苯丙烷代謝酚酸類物質的合成，從而抑制病原物的生長繁殖［29］。真菌感染、機械損傷及化學誘導子等刺激下均能引起C4 H基因的過表達［30］。在本研究中L.exsertum在接種尖鐮孢菌后0～20 d內可顯著激發其體內C4 H的活性，印證了前人的研究。

4 C L是木質素生物合成途徑中的關鍵合成酶，可以以肉桂酸、ρ-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等物質作為前體，合成苯丙烷酸的Co A酯，在抵御植物病害襲擊、抗擊外來侵襲、維持植物正常生長等方面發揮著巨大的作用［31］。在本研究中L.exsertum在接種尖鐮孢菌后0～20 d內可顯著激發其體內4 C L的活性，也與前人的研究結果類似。

對苯丙烷途徑關鍵酶以及相關產物積累的研究表明，接種尖鐮孢菌后L.exsertum體內的P A L、C4 H、4 C L活性增加幅度均顯著大于寧杞一號，并且L.exsertum的死亡率也最低。表明L.exsertum在其抗病過程中P A L、C4 H、4 C L等起到了重要作用，對尖鐮孢菌的侵染具有較強的抵抗能力。因此通過本研究，初步可以確定苯丙烷代謝關鍵酶以及相關產物在枸杞抗根腐病過程中具有重要的作用，但在基因水平上是如何控制其酶活的表達還有待進一步研究。

3.3 總酚和類黃酮等苯丙烷代謝關鍵產物在抗枸杞根腐病中的作用

由4 C L催化和合成的苯丙烷酸的Co A酯進一步合成木質素、總酚以及類黃酮等對病原菌有殺滅作用的各種次生代謝物質［32］。酚類物質可氧化成有直接毒性的醌類物質，能有效抑制病原菌的擴展［33］，以提高植物的抗病能力。劉美艷等［34］認為甘薯塊根中類黃酮、總酚含量的提高，有利于提高抗黑斑病的能力；劉普等［35］認為梨樹腐爛病發病程度與枝條韌皮部總酚含量呈顯著正相關關系；但丁謙等［36］對甜瓜（Cucumis melo）的類黃酮和總酚的含量表明抗感病品種間難以找出規律性。在本研究中L.exsertum在接種尖鐮孢菌后0～20 d內可顯著提高類黃酮的含量，但是總酚含量無相關規律，其原因有待于進一步研究。

另外，在本研究中不論接種尖鐮孢菌與否，第4天均出現了酶活及物質含量變化急劇，可能與切根接種有關，這種接種方式對植株造成的機械損傷可能引起了苯丙烷途徑相關物質的變化。

4 結論

6種參試材料接種根腐病強致病菌尖鐮孢菌后，野生種材料較栽培材料抗病性較強，寧杞一號為感病材料，L.exsertum抗根腐病能力最強。

抗病材料L.exsertum苯丙烷代謝關鍵酶P A L、C4 H、4 C L活性顯著高于寧杞一號，初步確定苯丙烷代謝中的P A L、C4 H、4 C L的活性和類黃酮的含量與枸杞材料抗根腐病呈正相關。因此，P A L、C4 H、4 C L酶活性和類黃酮含量，初步可以作為篩選抗枸杞鐮孢菌根腐病的生化指標。

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Effects of key enzymes and products in phenylpropanoid pathway of Lycium infected by Fusarium oxysporum

LI Jie1，FE N G Li-Dan1，Y A N G Cheng-De1，WA N G You-Ke1，H E Jing1，Z H A N G Bao-Lin2，C H E N Xiu-Rong1*
1.Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Academy of Forestry Science，Lanzhou 730020，China

In this study，the phenylpropanoid path way of the interaction of w olfberry and root rot pathogens will be discussed.T he relationship between w olfberry phenylpropanoid path way and disease resistance will be clarified.In this study，the experim ental m aterials are cultivated varieties NingqiⅠ，NingqiⅡ；do m estic wild species Lycium chinense，L.barbarum；wild species of A m erica L.brevipes，L.exsertum.T he strong pathogenic Fusarium oxysporum isolated fro m the onset of w olfberry will be inoculation by root cutting m ethod.A nd the anti-sense w olfbeey will be choose.T his 2 kinds of w olfberry as m aterials to study the change of phenylalanine a m m onia lyase，cinna mic acid hydroxylase，4-hydroxylase p-cou m aric acyl-coenzy m e A ligase，phenolics and flavonoids in 20 days.T he results show that the disease resistance of wild m aterials are strong than the cultivated m aterialin 6 kinds of test m aterials w hich were inoculated with w olfberry root rot strong pathogen F.oxysporum.NingqiⅠis susceptible m aterials.T he resistance to root rot disease of L.exsertum are strongest.T he key enzy m es of phenylpropanoid path way like phenylalnine a m m onialyase，trans-cinna mic acid-4-hydroxylase，4-cou m arate：coenzy m e A ligase activity are significantly higher than NingqiⅠ.Initially identified the phenylalnine a m m onialyase，trans-cinna mic acid-4-hydroxylase，4-cou m arate：coenzy m e A ligase activity and flavonoid content of phenylpropanoid path way of test m aterial resistance to root rot disease was positively correlated.T herefore，the phenylalnine a m m onialyase，trans-cinna mic acid-4-hydroxylase，4-cou m arate：coenzy m e A ligase enzy m e activity and flavonoid content can be a screening of anti-Chinese w olfberry Fusarium root rot of bioche micalindexes preliminary.

Lycium spp.；root rot；Fusarium oxysporum；phenylpropanoid path way；disease resistance

.E-m ail：chenxiurong＠gsau.edu.cn

10.11686/cyxb2016024

2016-01-19；改回日期：2016-03-08

國家林業局“948”項目（2011-4-39），甘肅中草藥科技攻關項目（G Y C11-01），甘肅省科技支撐項目（1304 F K C A054）和甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金（G S A U-S T S-1338）資助。

李捷（1981-），男，四川仁壽人，講師，在讀博士。E-m ail：lj81658＠gsau.edu.cn