CD8+T細胞在CA16感染手足口病中的表達變化及潛在作用*

李莉

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CD8+T細胞在CA16感染手足口病中的表達變化及潛在作用*

李莉①

【摘要】目的：對比分析15～24個月及2～5歲CA16感染的普通型與危重癥手足口病（hand，footand mouthdisease，HFMD）患者外周血中CD8+T細胞的表達情況，尋找發(fā)現(xiàn)與CA16致病有關的免疫病理因素。方法：收集2014年5-8月間昆明市兒童醫(yī)院感染科確診的兒童HFMD病例外周血標本共72例，其中普通型32例，危重癥40例，采用流式細胞術對患者外周血CD8+T淋巴細胞亞群進行檢測分析。結果：15～24個月普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細胞百分比略高于正常健康兒童參考值，而危重癥患者CD8+T細胞略低于正常參考值。此外，與正常參考值相比，2～5歲普通型及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者。結論：CA16感染后，不同年齡、不同病情的HFMD患者外周血中CD8+T細胞的表達變化不太明顯，說明CA16感染后，患者體內的CD8+T細胞基本能夠發(fā)揮正常的抗病毒免疫效應。而在危重癥時，兩個年齡段患者CD8+T細胞百分比略低或減低，說明CA16的持續(xù)性感染可能對機體CD8+T細胞的表達產(chǎn)生了影響，使其殺傷病毒效應減低，這可能是CA16感染誘導神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生的免疫病理因素之一。

【關鍵詞】CA16；CD8+T細胞；手足口病；作用

云南省衛(wèi)生科技計劃項目（2014NS052）

①昆明市兒童醫(yī)院云南昆明650228

First-author’s address：Children’s Hospital of Kunming，Kunming 650228，China

病毒感染后機體內部的天然免疫系統(tǒng)雖然能夠快速激活并誘導、招募適應性免疫應答的抗病毒免疫效應，但機體內感染病毒的復制傳播能力仍在增加［1-3］。作為特異性殺傷病毒感染細胞的CD8+T細胞，能在病毒感染后快速激活并清除病毒，極大地抑制體內病毒的復制，但體內殘存的病毒依然能夠逃避機體的免疫自穩(wěn)，造成體內中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性感染。這是由于CD8+T細胞在急性感染期快速清除病毒后，機體內病毒載量已經(jīng)降低到機體無法識別的水平，此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD8+T細胞受刺激減少、數(shù)量減低，僅有少量存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，而此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還可能殘存少量未清除的病毒RNA。當機體內環(huán)境紊亂，患者疾病惡化時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的病毒很可能會再次發(fā)生復制，感染神經(jīng)系統(tǒng)，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中少量CD8+T細胞無法全部快速識別并殺傷病毒感染細胞，最終促使患者出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎等，甚至威脅生命［4-6］。

柯薩奇病毒是微小核糖核酸病毒家族中的成員之一，是感染人類的重要腸道病原體。雖然大多數(shù)感染呈現(xiàn)亞臨床或輕度癥狀，但一些急性新生兒感染也常會導致患者病情惡化甚至死亡［7］。近年來暴發(fā)的兒童手足口病（Hand，footandmouthdisease，HFMD）， 柯 薩 奇 病 毒A16（Coxsackievirus16，CA16）就是主要致病病原體之一，5歲以下兒童均極易感染。作為柯薩奇病毒成員之一，CA16感染人體后，患者表現(xiàn)的臨床癥狀大多數(shù)較輕，能夠自行消退，但少數(shù)重癥病例也會發(fā)生病情惡化并致死的情況［8-13］。目前對于CA16急性感染期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CD8+T細胞能否抑制殘留病毒RNA的再次活化或是導致免疫病理反應的發(fā)生，或者還是同時參與保護機體及導致疾病還不明確。有研究顯示患者感染CA16，體內的抗病毒抗體陽性率增高，提示體液免疫參與了抗CA16的過程，對于細胞免疫在抗CA16中的作用研究還相對較少［14-15］。由于CA16引發(fā)的重癥病例多表現(xiàn)出嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，而CD8+T細胞又是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起主要殺傷病毒感染細胞的免疫細胞，因此，本研究主要通過比對分析不同年齡段CA16感染的普通型、危重型HFMD患者外周血中CD8+T細胞的表達差異，尋找發(fā)現(xiàn)與疾病負擔加重有關的免疫因素，進而為臨床準確判斷并分析疾病提供可參考的理論依據(jù)［16］。

1　資料與方法

1.1一般資料根據(jù)衛(wèi)生部《手足口病診療指南》（2010年版）及《腸道病毒71型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識》（2011年版）的診斷標準，選取2014年5-8月昆明市兒童醫(yī)院感染科確診的CA16感染的手足口病病例外周血標本共72例，其中普通病例共36例，15～24個月及2～5歲年齡段患者為16例及20例；危重癥病例共36例，15～24個月及2～5歲年齡段患者為16例及20例［17-18］。

1.2試劑及主要儀器試劑：采用BD公司生產(chǎn)的檢測淋巴細胞亞群的試劑盒BDMultitest6-color TBNKReagent。該試劑盒中包括識別富集不同淋巴亞群（T細胞、B細胞以及NK細胞）的抗體，其中包括識別NK細胞的抗體（CD16和CD56PE）、識別T細胞的抗體（CD3FITC）、為淋巴細胞群設置的CD45PerCP-Cy?5.5、檢測CD4+T細胞的CD4 PE-Cy?7、識別B淋巴細胞的CD19APC以及識別CD8+T細胞的CD8APC-Cy7。主要檢測儀器：BD FACSCanto?，使用BDFACSCanto?軟件進行參數(shù)設置、質控監(jiān)測以及數(shù)據(jù)分析。

1.3方法流式細胞儀檢測：采集靜脈血2～3mL，注于EDTA-Na抗凝管中。按照操作說明書，分別向已編好號的試管中加入20μL六色單克隆抗體和同型對照，分別向試管中加入混勻的100μL抗凝血；混勻，避光，室溫孵育15～20min；加入已稀釋好的溶血素600μL混勻避光室溫溶血8～10min，上機檢測。

1.4統(tǒng)計學處理采用PEMS3.1軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，由于本研究中同一年齡段普通型、危重癥的病例數(shù)各不相同，因此采用中位數(shù)以及5%～95%置信區(qū)間進行統(tǒng)計學分析。

2　結果

2.115～24個月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況比較根據(jù)中位數(shù)及95%置信區(qū)間結果顯示（圖1），普通型HFMD患者外周血CD8+T淋巴細胞亞群在外周血中所占百分比為20.365%，5%～95%置信區(qū)間為24.265%～37.4375%，略高于正常健康兒童參考值（20%，11%～32%），而危重癥患者CD8+T淋巴細胞亞群在外周血中所占百分比為19.29%，5%～95%置信區(qū)間為11.2985%～38.901%略低于正常參考值。說明此年齡段患者感染CA16初期癥狀較輕，其體內CD8+T細胞受病毒刺激后能夠擴增，但不明顯；當患者病情危重時，CD8+T細胞數(shù)量略微減低，說明病毒感染后期，其體內CD8+T細胞的免疫活性很可能受到病毒復制的影響，但影響不大。總的來說，該年齡段的普通及危重癥患者感染CA16后，其體內的CD8+T細胞均具有免疫活性，但活性不高，推測在抗CA16感染過程中，CD8+T細胞雖能發(fā)揮正常的抗病毒免疫反應，但抗病毒作用不強，這很可能是病毒能夠反復感染、無法從人體內完全清除的原因。

圖1　15~24個月普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況

2.22～5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況比較根據(jù)中位數(shù)及95%置信區(qū)間結果顯示（圖2），普通型患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比為21.11%，5%～95%置信區(qū)間為20.09%～38.985%；危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比為20.86%，5%～95%置信區(qū)間為14.3185%～40.2085%，與正常健康兒童參考值（24%，14%～33%）相比，普通及危重癥患者外周血中CD8+T淋巴細胞百分比均減低，其中危重癥患者略低于普通型患者，說明該年齡段不同患者體內的CD8+T細胞的免疫活性均減低，尤其在危重癥時更低。另外，與上述15～24個月普通型患者CD8+T細胞略高于正常參考值相反的是，該結果中2～5歲普通型患者體內CD8+T細胞卻低于正常參考值。一般來說，兒童淋巴細胞亞群數(shù)量的變化與年齡密切相關。正常情況下，2～5歲正常兒童CD8+T細胞的參考值高于15～24個月兒童的參考值，即隨年齡增高，CD8+T細胞的表達是升高的。但該結果顯示2～5歲普通型HFMD患兒的CD8+T細胞減低，僅略高于15～24個月兒童的正常參考值，這說明年齡較大的HFMD兒童的CD8+T細胞略高于年齡較小的兒童，雖然升高幅度不高，但也可以說明CA16感染的普通型HFMD患者的CD8+T細胞表達基本正常，其免疫學活性受到較小的影響。除此之外，與上述15～24個月危重癥患者相似的是2～5歲危重癥患者體內的CD8+T細胞減低，且減低較明顯，提示這一年齡段患者病情危重時，其體內的CD8+T細胞介導的細胞毒性反應很可能受到病毒復制機制的干擾或抑制，這也很可能是這一年齡段患者急性感染期發(fā)生嚴重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的原因，即體內清除病毒的主要免疫細胞CD8+T細胞的數(shù)量及活性減低。

圖2　2~5歲普通型與危重癥HFMD患者CD8+T細胞的表達情況

3　討論

大多數(shù)研究表明，CD8+T細胞在應對不同病毒感染時其免疫效應是多樣化的。急性感染時，對病毒具有特異性殺傷作用的CD8+T細胞會被迅速激活并大量擴增，同時，體內其他免疫調節(jié)因素也會同時發(fā)揮抗病毒免疫效應。當T細胞免疫反應達到頂峰時，90%的急性效應CD8+T細胞會死亡，其余的CD8+T細胞會分化為記憶性T細胞，存在于人體內。此時，人體內的病毒感染細胞大量被殺死，但病毒RNA還殘留于人體內，對機體造成持續(xù)性的慢性感染［19-22］。

本研究對比了不同年齡段普通型和危重癥患者外周血CD8+T細胞的表達差異，結果發(fā)現(xiàn)不論年齡大小，危重癥患者的CD8+T細胞都低于普通型患者，這很可能與病毒感染的急性和持續(xù)性有關。CD8+T細胞一般會在急性感染期迅速擴增，清除體內不斷復制的病毒，而當病毒持續(xù)感染時，體內抗病毒的關鍵免疫細胞很可能會是其他免疫細胞，如B細胞或CD4+T細胞。對于危重癥患者來說，病毒的持續(xù)性感染是疾病負擔加重的主要原因，此時，CD8+T細胞減低很可能與感染的病毒類型以及機體免疫系統(tǒng)調節(jié)機制有關。

此外，本研究不僅反映了HFMD患者體內CD8+T細胞的表達水平，也可反映出CA16對機體內CD8+T細胞的免疫刺激活性較低，在15～24個月普通型患者中，CD8+T細胞略高，而在2～5歲普通型患者中略低。一般來說，患者在感染初期癥狀較輕，但屬于急性感染，此時CD8+T細胞應該處于迅速擴增清除病毒的狀態(tài)，但本結果中未觀察到CD8+T細胞的大量擴增。這一方面說明，CA16感染初期，由于其致病性低及對患者造成的疾病負擔較輕，因此機體特異性的CD8+T細胞的擴增不明顯。另一方面，CD8+T細胞在2～5歲普通型患者中減低，很可能是該年齡段患者容易感染并發(fā)生嚴重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的原因，具體致病機制可能與感染后期中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CD8+T細胞數(shù)量減少以及病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中潛在復制、持續(xù)性感染有關。

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The Potential Function of Varied Expression of CD8+T Cells Against CA16

LI Li.
Medical Innovationof China，2016，13（13）：006-009

【Abstract】Objective：TocompareandanalyzetheexpressionofCD8+Tlymphocytessubsetinperipheral bloodindifferentchildrenwithhand，footandmouthdisease（HFMD）infectedbyCA16betweentheagegroups of15to24monthsand2to5years，whichmightdisclosetheimmunopathologicfactorsrelatedtothepathogenicity ofCA16.Method：72caseswithHFMDofperipheralbloodsampleswerecollectedinthedepartmentofinfectious diseaseinKunmingChildren’sHospitalfromMaytoAugust2015，whichincluded32mildcasesand40critical cases.TheexpressionofCD8+Tlymphocytesubsetsinpatients’peripheralbloodsampleweredetectedbytheflow cytometry.Result：ThepercentageofCD8+Tlymphocyteinmildpatientsfrom15to24monthswasslightlyhigher thanthereferencevalueofCD8+Tcellsinnormalhealthychildren，whilethepercentageofCD8+Tlymphocytein criticalcaseswasslightlylowerthanthenormalreferencevalue.Inaddition，comparedwiththereferencevalue ofCD8+Tcellsinnormalhealthychildrenwithin2to5yearsold，theexpressionofCD8+Tcellswasdecreasedin bothofmildandcriticalpatientswithin2to5yearsold，andthedecreaserelativelyobviousincriticalpatients. Conclusion：Inthesetwoagegroupsbetween15to24monthsand2to5years，theexpressionofCD8+Tcellsin differentpatientsinfectedbyCA16variedlessobviously，whichmightcanbeexplainedthattheenoughquantity ofCD8+Tcellsshouldplayitsimmuneeffectonkillinginfectedcellsasnormal.Forthereasonoftheexpressionof CD8+Tcellsisslightlylowerordecreasedincriticalcasesofthesetwoagegroups，itmaybeassociatedwiththe persistenceinfectionofCA16affectedtheexpressionofCD8+Tcells，whichattributetothelowerkillingeffectof CD8+Tcells.Itmightbeoneoftheimmunopathologicfactorsresultedintheoccurrenceofneurologicalcomplication inducedbyCA16.

【Key words】Coxsackievirus16；CD8+Tcells；Hand，footandmouthdisease（HFMD）；Function

*基金項目：云南省科技計劃青年項目（2012FD100）；

通信作者：李莉

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.13.002

收稿日期：（2015-12-30）（本文編輯：周亞杰）