阿托伐他汀及尼可地爾后處理對兔缺血再灌注損傷心肌的保護作用

李艷芳 費麗萍 劉云江（長治醫學院附屬和濟醫院心內科，山西 長治 046000）

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阿托伐他汀及尼可地爾后處理對兔缺血再灌注損傷心肌的保護作用

李艷芳 費麗萍 劉云江
（長治醫學院附屬和濟醫院心內科，山西 長治 046000）

【摘要】目的 建立缺血再灌注模型，觀察阿托伐他汀、尼可地爾后處理對兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用，并對其作用機制進行研究。方法50只大白兔隨機分成5組A～E（空白對照組A組、平行對照組B組、阿托伐他汀組C組、尼可地爾組D組、聯合后處理組E組），采用“二線二結法”建立缺血再灌注模型。各組按照實驗設計方案給藥。試劑盒檢測SOD、MDA。電鏡檢測心肌超微結構的變化。RT-PCR檢測HIF-1α。結果 ①與A組相比，B～E組血清MDA含量明顯增加(P<0.05)，而SOD明顯降低(P<0.01)；與B組比較，C～E組血清MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著提高(P<0.01)；與C、D組比較，E組MDA含量及SOD活性均無顯著性差異(P>0.05)。②電鏡觀察，缺血后處理組心肌細胞的損傷明顯減輕。③RT-PCR檢測HIF-1α，與A組相比，B～E組HIF-1αmRNA表達增高(P<0.01)，顯示缺血再灌注能增強其表達；其中C～E組又較B組增高(P<0.05)，顯示缺血后處理更能增強其表達。結論 ①阿托伐他汀、尼可地爾后處理對兔心肌缺血再灌注損傷有保護作用，可以改善再灌注后心肌的組織結構。②阿托伐他汀、尼可地爾后處理可能通過減輕氧化應激、減輕細胞凋亡發揮心肌保護作用。【關鍵詞】阿托伐他汀；尼可地爾；再灌注損傷；藥物后處理

急性心肌梗死嚴重危害人類健康，及時開通罪犯血管是治療本病的重要方法，但是長時間心肌缺血后的再灌注會引起心肌細胞的缺血再灌注損傷[1]。2005年Staat等[2]率先在臨床上證實了缺血后處理的心肌保護作用。藥物后處理是指在缺血之后、再灌注之前使用模擬內源性保護機制的藥物來產生類似經典后處理的保護作用。尋找對再灌注器官有保護作用的藥物可能更適合臨床。

本研究通過建立缺血再灌注模型，觀察阿托伐他汀、尼可地爾及二者聯合用藥后處理對大白兔心肌缺血再灌注損傷的保護作用，并對其可能的保護機制進行研究，以期為臨床心肌缺血再灌注保護的藥物選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物：健康大白兔50只，雌雄占各半，體質量1.5～2.5 kg，由長治醫學院動物部供應。按照“山西省醫學類實驗動物飼養及管理條例”及“國際實驗動物管理條例”進行喂養和處理實驗動物。

1.2 試劑：阿托伐他汀輝瑞制藥公司；尼可地爾中外制藥株式會社；SOD、MDA測試盒南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器：721分光光度儀：上海第三分析儀器廠；H-7500透射電子顯微鏡：日立。

1.4 方法及實驗流程

1.4.1 分組、建模：50只大白兔隨機分成5組（空白對照組A組、平行對照組B組、阿托伐他汀組C組、尼可地爾組D組、聯合后處理組E組），采用“二線二結法”建立缺血再灌注模型[3]。A組在穿線30 min后灌胃生理鹽水5 mL，B～E組分別在缺血30 min后灌胃生理鹽水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+生理鹽水5 mL、尼可地爾4 mg/kg+生理鹽水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+尼可地爾4 mg/kg+生理鹽水5 mL。給藥20 min后（即缺血50 min）恢復再灌注，再灌注2 h。

1.4.2 血液標本采集及指標檢測：各組分別于結扎前、開放2 h經股動脈采血2 mL，4000 rpm離心10 min，-70 ℃保存，試劑盒檢測SOD、MDA。

1.4.3 心肌超微結構電鏡觀察：每組隨機選擇5只兔子進行心肌超微結構觀察。再灌注結束后，結扎線以下2 mm處取標本并修剪為1 mm3大小，行前固定后置于緩沖液中冰箱4 ℃保存備用。

1.4.4 HIF-1α的RT-PCR檢測：①總RNA提取。②RT（逆轉錄）。③real-time PCR（聚合酶鏈反應）。

反應體系如下：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10 μL，上游引物（15 μmol/L）0.5 μL，下游引物（15 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2 μL，無DNAse和RNAse的水7 μL，共20 μL。

PCR反應條件如下：94 ℃預變性10 min，活化Tag酶；94 ℃15 s，60 ℃60 s，共循環45次。

熒光定量PCR讀取CT（cycle threshold）值，利用2-ΔΔCT進行計算[4]，表示實驗組測定指標X的表達相對于對照組樣本X表達的變化倍數。1.4.5 統計學分析：用SPSS17統計軟件包進行統計處理，組間比較及組內比較分別采用one-way ANOVA分析和LSD-t檢驗，P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標檢測結果比較見表1。

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標檢測結果比較(±s)

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標檢測結果比較(±s)

注：與B組比較▲P＜0.01

分組　MDA(nmol/mL)　SOD(U/mL) A 5.58±0.82　134.23±6.08 B 8.26±0.90　90.96±3.84 C 6.32±0.39▲　122.98±3.39▲D 6.52±0.63▲　118.88±8.66▲6.54±1.01▲　117.66±7.61▲E

2.2 心肌超微結構變化：A組心肌細胞排列整齊，結構完整，Z線清楚，線粒體結構完整；B組心肌排列模糊，不整齊，細胞水腫，Z線不清，線粒體嚴重腫脹，并空泡化；C～E組心肌纖維排列輕度模糊，細胞輕度水腫，線粒體輕度腫脹，脊模糊。心肌組織的電鏡觀察結果見圖1。

圖1 心肌組織的電鏡觀察結果（×20000倍）

2.3 HIF-1α的檢測：與A組相比，B-E組HIF-1αmRNA表達增強（P<0.01），顯示缺血再灌注能增強其表達；其中C-E組又較B組增高（P<0.05），說明缺血后處理更能增強其表達。

3 討 論

藥物后處理對缺血再灌注損傷心肌的保護作用是目前心肌保護領域的研究熱點。他汀類藥物的多效性近年來被給予較多關注，調脂之外還有改善內皮細胞、抗炎、穩定斑塊、抗細胞凋亡等多效性[5]。尼可地爾對體外培養的心肌細胞有抗凋亡作用[6]。目前研究認為抑制氧自由基的堆積、減輕氧化應激是缺血再灌注保護作用機制之一[7]。本研究顯示，經后處理組織超氧化物歧化酶（SOD）升高，脂質過氧化物產物丙二醛（MDA）顯著降低，進一步證明后處理通過減少再灌注初期的氧自由基的生成，抑制細胞膜的脂質過氧化反應，減輕氧化應激，保護再灌注器官。Piot等[8]證實了細胞凋亡及壞死均存在于缺血再灌注損傷心肌中，并且其心肌梗死面積的大小與缺血再灌注損傷后的細胞凋亡的嚴重程度相關。研究發現[9]，缺血預處理與后處理的心肌保護作用可能與促進激活低氧誘導因子-1α（HIF-1α）的高表達有關。組織缺血缺氧時可啟動一系列應答反應，其中HIF-1是一種關鍵性的轉錄因子，可調控近200個下游基因的轉錄激活來介導組織細胞對缺氧的適應性反應。并且心肌細胞的凋亡數明顯減少，提示HIF-1α的心肌保護作用可能與抑制心肌細胞凋亡有關[10]。本研究結果認為阿托伐他汀、尼可地爾對缺血再灌注心肌有保護作用，可能通過改善氧化應激、減輕細胞凋亡發揮作用。

參考文獻

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[10] 郝瀟,李樹仁.低氧誘導因子1對心臟保護作用的研究進展[J].基礎醫學與臨床,2015,35(4):554-556.

中圖分類號：R54

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）11-0005-02

基金項目：長治市科技局課題（20123059）

The Research of the Cardio Protective Effect of Ischemic Postcondi tioning against Myocardial Ischemia and Reperfusi on Injury in Rabbit

LI Yan-fang, FEI Li-ping, LIU Yun-jiang
(Department of Cardiology, Heji Hospital Affiliated to Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

[Abstract]Objective To observe the cardio protective effect of myocardial ischemic postconditioning against ischemia and reperfusion induced injury in rabbit heart. Methods 50 rabbits were randomly divided into 5 groups, and the myocardial ischemia-reperfusion were generated by two sutures and two knots, and then administrated in accordance with the experimental design, testing SOD and MDA in serum, observing the changes of myocardial structure, testing HIF-1α by RT-PCR. Results The MDA levels of group C-E were significantly lower than B (P<0.01) but the SOD were higher than B (P<0.01). The injury of group B was worse than C-E of the cellular structure under EM. The HIF-1αmRNA levels of group B-E were higher than that of group A（P<0.01), and C-E higher than B (P<0.05). Conclusion Myocardial isehemic postconditioning of atorvastatin and nicorandil induced cardio protection against ischemia reperfusion injury in rabbits. They can improve structure under microscope, maybe through reducing oxidative stress and reducing cell apoptosis.

[Key words]Atorvastatin; Nicorandil; Pharmacological postconditioning; Ischemia and reperfusion injury