阿托伐他汀及尼可地爾后處理對(duì)兔缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用

李艷芳 費(fèi)麗萍 劉云江（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046000）

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阿托伐他汀及尼可地爾后處理對(duì)兔缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用

李艷芳 費(fèi)麗萍 劉云江
（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046000）

【摘要】目的 建立缺血再灌注模型，觀察阿托伐他汀、尼可地爾后處理對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。方法50只大白兔隨機(jī)分成5組A～E（空白對(duì)照組A組、平行對(duì)照組B組、阿托伐他汀組C組、尼可地爾組D組、聯(lián)合后處理組E組），采用“二線二結(jié)法”建立缺血再灌注模型。各組按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥。試劑盒檢測(cè)SOD、MDA。電鏡檢測(cè)心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。RT-PCR檢測(cè)HIF-1α。結(jié)果 ①與A組相比，B～E組血清MDA含量明顯增加(P<0.05)，而SOD明顯降低(P<0.01)；與B組比較，C～E組血清MDA含量顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著提高(P<0.01)；與C、D組比較，E組MDA含量及SOD活性均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。②電鏡觀察，缺血后處理組心肌細(xì)胞的損傷明顯減輕。③RT-PCR檢測(cè)HIF-1α，與A組相比，B～E組HIF-1αmRNA表達(dá)增高(P<0.01)，顯示缺血再灌注能增強(qiáng)其表達(dá)；其中C～E組又較B組增高(P<0.05)，顯示缺血后處理更能增強(qiáng)其表達(dá)。結(jié)論 ①阿托伐他汀、尼可地爾后處理對(duì)兔心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，可以改善再灌注后心肌的組織結(jié)構(gòu)。②阿托伐他汀、尼可地爾后處理可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】阿托伐他??；尼可地爾；再灌注損傷；藥物后處理

急性心肌梗死嚴(yán)重危害人類健康，及時(shí)開通罪犯血管是治療本病的重要方法，但是長(zhǎng)時(shí)間心肌缺血后的再灌注會(huì)引起心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷[1]。2005年Staat等[2]率先在臨床上證實(shí)了缺血后處理的心肌保護(hù)作用。藥物后處理是指在缺血之后、再灌注之前使用模擬內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的藥物來(lái)產(chǎn)生類似經(jīng)典后處理的保護(hù)作用。尋找對(duì)再灌注器官有保護(hù)作用的藥物可能更適合臨床。

本研究通過(guò)建立缺血再灌注模型，觀察阿托伐他汀、尼可地爾及二者聯(lián)合用藥后處理對(duì)大白兔心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其可能的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床心肌缺血再灌注保護(hù)的藥物選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物：健康大白兔50只，雌雄占各半，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院動(dòng)物部供應(yīng)。按照“山西省醫(yī)學(xué)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及管理?xiàng)l例”及“國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例”進(jìn)行喂養(yǎng)和處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 試劑：阿托伐他汀輝瑞制藥公司；尼可地爾中外制藥株式會(huì)社；SOD、MDA測(cè)試盒南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器：721分光光度儀：上海第三分析儀器廠；H-7500透射電子顯微鏡：日立。

1.4 方法及實(shí)驗(yàn)流程

1.4.1 分組、建模：50只大白兔隨機(jī)分成5組（空白對(duì)照組A組、平行對(duì)照組B組、阿托伐他汀組C組、尼可地爾組D組、聯(lián)合后處理組E組），采用“二線二結(jié)法”建立缺血再灌注模型[3]。A組在穿線30 min后灌胃生理鹽水5 mL，B～E組分別在缺血30 min后灌胃生理鹽水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+生理鹽水5 mL、尼可地爾4 mg/kg+生理鹽水5 mL、阿托伐他汀30 mg/kg+尼可地爾4 mg/kg+生理鹽水5 mL。給藥20 min后（即缺血50 min）恢復(fù)再灌注，再灌注2 h。

1.4.2 血液標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)：各組分別于結(jié)扎前、開放2 h經(jīng)股動(dòng)脈采血2 mL，4000 rpm離心10 min，-70 ℃保存，試劑盒檢測(cè)SOD、MDA。

1.4.3 心肌超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察：每組隨機(jī)選擇5只兔子進(jìn)行心肌超微結(jié)構(gòu)觀察。再灌注結(jié)束后，結(jié)扎線以下2 mm處取標(biāo)本并修剪為1 mm3大小，行前固定后置于緩沖液中冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 HIF-1α的RT-PCR檢測(cè)：①總RNA提取。②RT（逆轉(zhuǎn)錄）。③real-time PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）。

反應(yīng)體系如下：FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）10 μL，上游引物（15 μmol/L）0.5 μL，下游引物（15 μmol/L）0.5 μL，cDNA 2 μL，無(wú)DNAse和RNAse的水7 μL，共20 μL。

PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性10 min，活化Tag酶；94 ℃15 s，60 ℃60 s，共循環(huán)45次。

熒光定量PCR讀取CT（cycle threshold）值，利用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算[4]，表示實(shí)驗(yàn)組測(cè)定指標(biāo)X的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組樣本X表達(dá)的變化倍數(shù)。1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，組間比較及組內(nèi)比較分別采用one-way ANOVA分析和LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較見表1。

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 再灌注2 h血清MDA、SOD指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

注：與B組比較▲P＜0.01

分組　MDA(nmol/mL)　SOD(U/mL) A 5.58±0.82　134.23±6.08 B 8.26±0.90　90.96±3.84 C 6.32±0.39▲　122.98±3.39▲D 6.52±0.63▲　118.88±8.66▲6.54±1.01▲　117.66±7.61▲E

2.2 心肌超微結(jié)構(gòu)變化：A組心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，Z線清楚，線粒體結(jié)構(gòu)完整；B組心肌排列模糊，不整齊，細(xì)胞水腫，Z線不清，線粒體嚴(yán)重腫脹，并空泡化；C～E組心肌纖維排列輕度模糊，細(xì)胞輕度水腫，線粒體輕度腫脹，脊模糊。心肌組織的電鏡觀察結(jié)果見圖1。

圖1 心肌組織的電鏡觀察結(jié)果（×20000倍）

2.3 HIF-1α的檢測(cè)：與A組相比，B-E組HIF-1αmRNA表達(dá)增強(qiáng)（P<0.01），顯示缺血再灌注能增強(qiáng)其表達(dá)；其中C-E組又較B組增高（P<0.05），說(shuō)明缺血后處理更能增強(qiáng)其表達(dá)。

3 討 論

藥物后處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用是目前心肌保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。他汀類藥物的多效性近年來(lái)被給予較多關(guān)注，調(diào)脂之外還有改善內(nèi)皮細(xì)胞、抗炎、穩(wěn)定斑塊、抗細(xì)胞凋亡等多效性[5]。尼可地爾對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞有抗凋亡作用[6]。目前研究認(rèn)為抑制氧自由基的堆積、減輕氧化應(yīng)激是缺血再灌注保護(hù)作用機(jī)制之一[7]。本研究顯示，經(jīng)后處理組織超氧化物歧化酶（SOD）升高，脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物丙二醛（MDA）顯著降低，進(jìn)一步證明后處理通過(guò)減少再灌注初期的氧自由基的生成，抑制細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)再灌注器官。Piot等[8]證實(shí)了細(xì)胞凋亡及壞死均存在于缺血再灌注損傷心肌中，并且其心肌梗死面積的大小與缺血再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[9]，缺血預(yù)處理與后處理的心肌保護(hù)作用可能與促進(jìn)激活低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的高表達(dá)有關(guān)。組織缺血缺氧時(shí)可啟動(dòng)一系列應(yīng)答反應(yīng)，其中HIF-1是一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控近200個(gè)下游基因的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)介導(dǎo)組織細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。并且心肌細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯減少，提示HIF-1α的心肌保護(hù)作用可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]。本研究結(jié)果認(rèn)為阿托伐他汀、尼可地爾對(duì)缺血再灌注心肌有保護(hù)作用，可能通過(guò)改善氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。

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中圖分類號(hào)：R54

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1671-8194（2016）11-0005-02

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)治市科技局課題（20123059）

The Research of the Cardio Protective Effect of Ischemic Postcondi tioning against Myocardial Ischemia and Reperfusi on Injury in Rabbit

LI Yan-fang, FEI Li-ping, LIU Yun-jiang
(Department of Cardiology, Heji Hospital Affiliated to Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

[Abstract]Objective To observe the cardio protective effect of myocardial ischemic postconditioning against ischemia and reperfusion induced injury in rabbit heart. Methods 50 rabbits were randomly divided into 5 groups, and the myocardial ischemia-reperfusion were generated by two sutures and two knots, and then administrated in accordance with the experimental design, testing SOD and MDA in serum, observing the changes of myocardial structure, testing HIF-1α by RT-PCR. Results The MDA levels of group C-E were significantly lower than B (P<0.01) but the SOD were higher than B (P<0.01). The injury of group B was worse than C-E of the cellular structure under EM. The HIF-1αmRNA levels of group B-E were higher than that of group A（P<0.01), and C-E higher than B (P<0.05). Conclusion Myocardial isehemic postconditioning of atorvastatin and nicorandil induced cardio protection against ischemia reperfusion injury in rabbits. They can improve structure under microscope, maybe through reducing oxidative stress and reducing cell apoptosis.

[Key words]Atorvastatin; Nicorandil; Pharmacological postconditioning; Ischemia and reperfusion injury