黃芪多糖對急性心肌梗死模型大鼠早期心功能、氧化應激及血清核轉錄因子-κB、脂肪因子水平的影響

趙國玉　李夢媛　崔　川　耿學斌

(唐山市工人醫院心血管內科，河北　唐山　063000)

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黃芪多糖對急性心肌梗死模型大鼠早期心功能、氧化應激及血清核轉錄因子-κB、脂肪因子水平的影響

趙國玉李夢媛崔川耿學斌

(唐山市工人醫院心血管內科，河北唐山063000)

〔摘要〕目的探討黃芪多糖(APS)對急性心肌梗死(AMI)大鼠模型早期心功能、氧化應激反應及血清核轉錄因子(NF)-κB、脂肪因子(Chemerin)水平的影響及其可能作用機制。方法選取60只SD大鼠，采用左冠狀動脈前降支結扎法構建大鼠心肌梗死模型，造模成功后大鼠隨機分為假手術組(SO組)、AMI模型組(AMI組)、抗壞血酸組(AA組)和APS組各15例。分別于手術前、術后即刻及給藥1、3、7、14 d觀察心電圖ST段變化。給藥14d后對各組大鼠進行超聲心動圖檢查。采用分光光度法檢測自由基清除率并檢測各組大鼠心肌中丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性水平。應用流式細胞術檢測各組大鼠心肌細胞凋亡率，應用酶聯免疫檢測法(ELISA)檢測血清NF-κB、Chemerin水平。結果與AMI組比較，APS能明顯抑制AMI模型大鼠心電圖ST段的升高；超聲心動圖結果顯示心臟結構方面，與SO組比較，AMI組舒張末期室間隔厚度(IVSD)、左室舒張末期后壁厚度(LVPWD)明顯變薄(P<0.05)；左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)明顯升高(P=0.000)；給藥2 w后，與AMI組比較，APS組IVSD、LVPWD明顯增加，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV明顯降低(均P<0.05)；心功能方面，與SO組比較，AMI組大鼠左室射血分數(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)明顯下降(P<0.05)；給藥2 w后，APS組LVEF、LVFS明顯增加(P<0.05)。APS和AA均能提高1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率，且APS對自由基的清除率稍高于AA；與SO組比較，AMI組大鼠心肌MDA水平升高，SOD和GSH-PX活性降低(P<0.05)；與AMI組相比，AA組和APS組心肌MDA水平下降，SOD和GSH-PX活性增強(P<0.05)。AMI組大鼠心肌細胞凋亡率與SO組比較顯著增加(P=0.000)，APS組與AMI組相比明顯降低(P=0.000)；AMI組大鼠血清NF-κB及Chemerin水平顯著升高，與SO組相比差異顯著(均P=0.000)；連續給藥2 w后，APS組血清NF-κB、Chemerin水平顯著降低，與AMI組比較有統計學差異(均P=0.000)。結論ARS能有效改善AMI模型大鼠心室重構及心功能，抑制心肌細胞凋亡，清除自由基；其心肌保護機制可能與降低NF-κB及Chemerin水平抑制炎癥反應有關。

〔關鍵詞〕黃芪多糖；急性心肌梗死；氧化應激；脂肪因子；核轉錄因子-κB

黃芪多糖(APS)具有抗病毒、抗腫瘤、抗應激、抗氧化等作用，還具有保護血管內皮細胞，促進其增殖和再生、抗動脈粥樣硬化、降血脂等多重心血管保護作用。目前針對急性心肌梗死(AMI)等危急重癥及相關機制方面的研究極少。本實驗擬通過觀察APS對AMI模型大鼠早期心功能的變化及氧化應激情況，以及APS對血清核轉錄因子(NF)-κB及脂肪因子(Chemeri)n水平的影響。

1材料與方法

1.1材料實驗動物：清潔級SD大鼠60只，體質量200～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXX(京)2006-2009。儀器與試劑：彩色多普勒超聲診斷儀(Philips IE33)；XD-7100型心電圖儀(上海醫用電子儀器廠)；Epics Altra流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；APS(陜西森弗生物技術有限公司)；抗壞血酸(AA，Sigma公司)；超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)活性測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒購于南京建成科技有限公司；大鼠Chemerin 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒、大鼠NF-κB ELISA試劑盒購自北京易科攀博生物科技有限公司，其余試劑為國產分析純。

1.2方法

1.2.1構建AMI大鼠模型參考文獻方法〔1〕，1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位，固定四肢及頭部，記錄心電圖后，消毒手術區域。沿胸骨左緣第4～5肋間隙剪開皮膚，鈍性分離肌肉，進入胸腔暴露心臟，然后在左心耳和肺動脈圓錐著左下緣2 mm處結扎左冠狀動脈前降支。觀察結扎下方心肌變白后，逐層關閉胸腔。以心電圖I和aVL導聯ST段持續性抬高0.2 mV以上，出現Q波及室性心律失常為心肌梗死模型制作成功標志。術后給予青霉素4萬U肌注，連用5 d，預防感染。假手術組只穿線不結扎冠狀動脈，其余步驟同前。

1.2.2分組及給藥按隨機數字表法將術后大鼠隨機分為四組，每組15只：APS組，100 mg/kg灌胃；AA組，100 mg/kg灌胃；模型組(AMI組)，用等容積生理鹽水灌胃；假手術組(SO組)，用等容積生理鹽水灌胃；以上各組均灌胃1次/d，連續2 w。2 w后腹主動脈取血，處死大鼠，留取心肌組織制備成勻漿液，備用。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1心電圖監測分別于手術前、術后即刻及給藥1、3、7、14 d觀察心電圖Ⅱ導聯ST段變化，并記錄S-T段值。

1.2.3.2超聲心動圖檢查給藥第14天，將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，左胸口脫毛，由同一個專職技師進行超聲心動圖檢查，測量舒張末期室間隔厚度(IVSD)、左室舒張末期后壁厚度(LVPWD)、左室舒張末期內徑(LVEDD)、左室收縮末期內徑(LVESD)，計算左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分數(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)。計數資料連續測量3個心動周期取平均值。

1.2.3.3自由基清除率采用分光光度法檢測，在10 ml比色管中依次加入4.0 ml 0.017 8 mmol/L1,1-二苯-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液和待測樣品，加入無水乙醇至刻度，混勻立即用1 cm比色皿在517 nm波長處測吸光值(A)，吸光值為Ai，再在溫室避光保存30 min后測吸光值，記為Aj，對照試驗為只加DPPH乙醇溶液，吸光值記為Ac。按下式計算自由基清除率(K)：K(%)=〔1-(Ai-Aj)/Ac〕×100%。APS、AA分別用無水乙醇配制成不同濃度的溶液，依次為10、20、50、100、150、200、250、300 mg/L。

1.2.3.4心肌MDA、SOD、GSH-PX含量測定心功能檢測完畢后，處死大鼠取左室缺血區心肌，加入適量生理鹽水，制成10%組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心15 min，取上清液備測。心肌細胞MDA檢測采用硫代巴比妥酸法，SOD檢測采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-PX測定采用比色法，嚴格按照說明書進行操作。

1.2.3.5心肌細胞凋亡率檢測取心肌梗死區與正常區之間的新鮮組織，用眼科剪刀剪碎，經0.25%胰蛋白酶37℃水浴鍋中消化后，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，反復幾次，將心肌裂解為單個細胞后，500 r/min離心5 min，棄上清液，再加入PBS清洗，重復3次，制成單細胞懸液，調整細胞密度為3×109/L。然后加入2 ml預冷的無水乙醇固定細胞12 h以上，離心后棄上清液，PBS洗滌3次，調整終體積為100 μl。再加入DNA-Stain染色液500 μl，于室溫下避光染色30 min。采用流式細胞術檢測大鼠心肌細胞凋亡率。

1.2.3.6血清NF-κB及Chemerin檢測給藥2 w后，采用腹主動脈取血法，每只大鼠取血6～8 ml，4 000 r/min離心10 min，試管分裝，-70℃冰箱保存，集中待測。采用ELISA法檢測NF-κB及Chemerin水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算標本中各指標的濃度。

1.3統計學方法采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1各組心電圖ST段值變化構建AMI大鼠模型后心電圖ST段明顯抬高，表明AMI模型構建成功；隨時間推移，術后各組心電圖ST值均呈下降趨勢，其中APS組下降尤為明顯，說明APS對AMI模型大鼠心肌損傷有明顯改善作用。見圖1。

圖1　各組心電圖ST段值的變化

2.2各組超聲心動圖檢查結果心臟結構方面，與SO組比較，AMI組IVSD、LVPWD明顯變薄(t=3.864，P=0.005；t=7.730，P=0.000)；LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV明顯升高(t=9.772，P=0.000；t=15.027，P=0.000；t=19.995，P=0.000；t=42.986，P=0.000)；給藥2 w后，與AMI組比較，AA組IVSD、LVPWD略有增加，但無統計學差異(t=0.189，P=0.855；t=0.162，P=0.875)，而APS組大鼠IVSD、LVPWD明顯增加(t=2.754，P=0.025；t=4.244，P=0.003)，LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV明顯降低(t=3.386，P=0.010；t=4.135，P=0.003；t=12.964，P=0.000；t=13.358，P=0.000)，而AA組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV略有下降，但無顯著性差異(t=1.187，P=0.269；t=0.198，P=0.848；t=1.793，P=0.111；t=1.34，P=0.217)。心功能方面，與SO組比較，AMI組大鼠LVEF、LVFS明顯下降(t=16.722，P=0.000；t=4.183，P=0.003)；給藥2 w后，與AMI組比較，APS組LVEF、LVFS明顯增加(t=3.757，P=0.006；t=2.820，P=0.023)，而AA組大鼠LVEF、LVFS略有增加，但無統計學差異(分別為t=1.341，P=0.217；t=0.135，P=0.896)。見表1。

表1　各組大鼠超聲心動圖檢測結果±s,n=15)

與SO組比較：1)P<0.01；與AMI組比較：2)P<0.05：3)P<0.01；下表同

2.3DPPH自由基清除率的檢測AA及APS對DPPH自由基均有明顯的清除效果，并且隨著其質量濃度的增加，清除率也逐步增大，在兩者濃度達到150 mg/L時，清除率趨于平緩。總體來看，APS的DPPH自由基清除能力稍強于AA。見圖2。

圖2　AA、APS自由基的清除能力

2.4各組大鼠心肌MDA、SOD、GSH-PX的表達水平與SO組比較，AMI組大鼠心肌MDA水平升高(t=41.105，P=0.000)，SOD和GSH-PX活性降低(t=16.035，P=0.000；t=6.728，P=0.000)；與AMI組相比，AA組和APS組心肌MDA水平下降(t=8.078，P=0.000；t=9.255，P=0.000)，SOD和GSH-PX活性增強(t=5.005，P=0.001；t=6.481，P=0.000；t=2.646，P=0.029；t=2.340，P=0.047)；與AA組比較，APS組MDA、SOD略有下降，GSH-PX稍有增高，但均無統計學差異(t=1.726，P=0.123；t=0.264，P=0.798；t=0.946，P=0.372)。見表2。

表2　各組心肌MDA、SOD、GSH-PX的檢測結果

2.5各組大鼠心肌細胞凋亡率比較AMI組大鼠心肌細胞凋亡率為(53.62±4.62)%，與SO組(23.39±4.24)%比較顯著增加(t=18.679，P=0.000)；APS組為(29.46±2.44)%，與AMI組相比明顯降低(t=17.927，P=0.000)；而AA組為(50.69±3.54)%，與AMI組比較無統計學差異(t=1.952，P=0.061)。

2.6各組大鼠血清NF-κB及Chemerin水平比較AMI組大鼠血清NF-κB及Chemerin水平顯著高于SO組(t=28.623，P=0.000；t=38.138，P=0.000)；連續給藥2 w后，APS組血清NF-κB、Chemerin水平顯著低于AMI組比較(t=20.319，P=0.000；t=25.692，P=0.000)，而AA組與AMI組比較均無明顯差異(t=1.674，P=0.105；t=1.938，P=0.063)。見表3。

表3　各組大鼠血清NF-κB及Chemerin含量

3討論

AMI可引起心肌代謝功能障礙和結構損傷，臨床上AMI特異性改變主要是通過心電圖和心肌酶譜的變化。本實驗心電圖監測結果顯示，APS能顯著降低大鼠心肌ST段的抬高，說明APS能在一定程度上改善心肌細胞損傷。

AMI后繼出現心室重構，病理表現為心肌細胞肥大和間質結構改變〔2〕。早期心室重構始于AMI后數小時，1～2 w時最重，4～6 w時結束〔3〕。早期左室擴大、室壁瘤形成及后期心力衰竭等多在梗死區膨展基礎上形成，及早有效地阻止或延緩AMI后早期心室重構至關重要〔4〕。本實驗說明AMI后出現心室壁變薄、心室擴大，左心室舒縮功能下降。另外表明APS干預后在一定程度上改善了左心室形態和舒縮功能。進一步分析說明APS早期一定程度上可以改善AMI后心室重構或延緩心室重構進程，改善心臟功能，有效防止心衰。

以往的實驗發現，APS具有良好的抗氧化作用，是天然的抗氧化劑〔5〕。APS主要通過增強抗氧化酶如SOD、GSH-PX、CAT等的活性，降低相關組織的過氧化脂質水平〔6〕。AA是常見的抗氧化劑，能有效清除氧自由基，提高SOD等抗氧化酶的活性。本實驗提示APS的DPPH自由基清除能力稍強于AA。

AMI后的一系列病理生理過程包括氧化應激、炎癥反應以及神經內分泌系統激活等。氧化應激產生大量氧自由基，脂質過氧化物MDA生成增多，而SOD、GSH-PX作為抗氧化劑因清除自由基大量消耗而降低〔7〕。研究表明，氧化應激與心肌梗死后心室重構密切相關，是心室重構的發生機制之一〔8〕。抗氧化劑可以緩解AMI后的心室重構。閔清等〔9〕研究提示APS對大鼠實驗性心肌缺血具有明顯保護作用。本文顯示APS可明顯提高AMI后SOD、GSH-PX的活性并降低了MDA含量，從而增強了內源性氧自由基清除系統的功能，抑制脂質過氧化作用，提示APS對AMI后心肌缺血損傷的保護與抗氧化作用有關。

AMI后在心梗區域大量巨噬細胞、中性粒細胞等聚集，出現局部的炎癥反應，許多炎癥因子如白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達增加NF-κB在心肌缺血/再灌注后被激活，促進心肌細胞的凋亡和壞死〔10〕。阻斷NF-κB可以減少心肌梗死的面積，減輕炎癥反應對血管內皮的損傷及心室重構的過程。研究發現，急性冠脈綜合征患者體內Chemerin水平有顯著升高〔11〕。在冠狀動脈粥樣硬化不穩定斑塊中的泡沫細胞和內皮細胞中存在Chemerin高表達〔12〕。彭清等〔13〕研究發現，動脈粥樣硬化大鼠血漿Chemerin水平、主動脈Chemerin及Chemerin受體mRNA表達水平與炎癥密切相關。謝霆等〔14〕研究發現，Chemerin下調ATP結合盒轉運子腺苷三磷酸結合轉運體A1(ABCA1)基因的表達，增加細胞內脂滴蓄積，NF-κB活化可能是Chemerin抑制ABCA1 mRNA表達的信號通路之一。此外，研究還發現Chemerin通過NF-κB介導的炎癥反應誘導C2C12細胞產生胰島素抵抗〔15〕。Chemerin可趨化巨噬細胞向炎癥部位聚集，并釋放多種炎癥因子如IL-6、TNF-α等，因此Chemerin與NF-κB兩者可能共同參與了斑塊形成、炎癥反應及血管內皮功能損傷等過程，導致不良心血管事件的發生。

APS的抗感染作用可能與抑制NF-κB通路進而降低炎癥因子水平有關〔16〕。APS在心血管疾病研究方面，孫雪芳等〔17〕研究發現，APS對LPS誘導的乳鼠心肌細胞有保護作用，其機制可能與抑制Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB信號通路有關。楊志霞等〔18〕研究表明，APS聯合丹參酮對慢性心衰心肌各細胞因子的表達具有重要的抑制效應，阻斷NF-κB信號通路可能對于慢性心衰心肌損傷具有潛在的治療價值。本研究結果提示APS對炎癥因子NF-κB及Chemerin的表達有明顯抑制作用，抑制了炎癥反應，從而改善心肌細胞的損傷。

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〔2016-02-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：李夢媛(1987-)，女，主治醫師，主要從事心血管疾病診治研究。

〔中圖分類號〕R541.4

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3144-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.022

第一作者：趙國玉(1973-)，女，主治醫師，主要從事冠心病介入治療研究。