凍存復蘇對臍帶間充質干細胞生物學特性的影響

韓　華，趙　靜，趙紅偉，李　潔，閆　萍

(河北省人民醫院,河北 石家莊 050051)

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凍存復蘇對臍帶間充質干細胞生物學特性的影響

韓華，趙靜，趙紅偉，李潔，閆萍

(河北省人民醫院,河北 石家莊 050051)

[摘要]目的觀察臍帶間充質干細胞經凍存復蘇后的生物學特性，并鑒定其是否具有間充質干細胞的特征。方法采用組織塊貼壁法從人臍帶組織中分離培養間充質干細胞，將傳至第3代的細胞進行凍存6個月后復蘇，觀察凍存前和凍存復蘇后細胞的形態學變化，比較凍存前后細胞的存活率，測定細胞生長曲線，并用流式細胞儀檢測凍存后細胞表面抗原的表達情況。結果組織塊貼壁法可以成功地分離培養臍帶間充質干細胞；經低溫凍存復蘇后細胞仍保持貼壁生長的特性，形態未發生明顯變化；復蘇后細胞存活率與未凍存細胞相比差異無統計學意義；凍存前后細胞的生長曲線相似；流式細胞儀分析凍存后細胞表面高表達間充質干細胞抗原CD29、CD90、CD44、CD105，低表達或不表達造血干細胞抗原CD34、CD45和白細胞相關抗原HLA-DR。結論凍存復蘇對臍帶間充質干細胞的生物學特性無明顯影響，凍存后細胞符合間充質干細胞的基本要求。

[關鍵詞]間充質干細胞；臍帶；凍存；生物學特性

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種重要的種子細胞，具有高度自我更新和多向分化潛能，能夠支持造血和調節免疫功能[1-2]，并且在特定的條件下，可以誘導分化成骨、軟骨、脂肪、心肌、骨骼肌等多種組織細胞[3-4]，能廣泛應用于組織工程研究以及臨床各種疾病的治療[5]。間充質干細胞的來源廣泛，最早是從骨髓中發現，后經研究證實在脂肪、肌肉、外周血、臍血、臍帶等組織中均存在間充質干細胞[6]。對于間充質干細胞的獲得，以前應用較多的是從骨髓組織中提取，但長期研究證明骨髓間充質干細胞的數量和其分化擴增能力隨年齡的增長而逐漸減少和減弱，而且骨髓的獲取是一種有創操作，不易采集，在細胞培養的過程中又容易感染，因而其應用受到限制。近年來，許多研究者逐漸嘗試從人臍帶組織中提取間充質干細胞，被稱為臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)。由于臍帶是來源于妊娠分娩時的廢棄物，來源廣泛，取材方便，不會引起倫理學方面的問題，并且臍帶間充質干細胞容易提取，增殖能力強，免疫原性低，成為目前細胞組織工程研究的熱點[7]。因而，如何高效、穩定地從臍帶組織中獲取間充質干細胞并將細胞進行儲存是研究中需要關注的方向[8-9]。本實驗中運用組織塊貼壁法從臍帶中分離培養間充質干細胞，并對獲取的細胞進行低溫凍存，觀察凍存復蘇后細胞的生物學特性和細胞活力，旨在為間充質干細胞的保存提供實驗依據。

1實驗資料

1.1標本采集采集2015年3—5月在河北省人民醫院婦產科正常足月妊娠剖宮產健康胎兒的臍帶，母體檢查乙肝五項+丙抗、人類免疫缺陷病毒、梅毒等傳染性指標均為陰性，排除母體家族遺傳病及胎兒先天性疾病，征得產婦和家屬的知情同意，實驗過程符合醫學倫理學標準并經醫院倫理委員會批準。

1.2實驗所用試劑及儀器DMEM/F12培養液(美國Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，小鼠抗人抗體藻紅蛋白(PE)標記的CD29、CD44、CD90、CD105、CD34，異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD45，人類白細胞抗原(HLA)-DR(美國BD公司)，二甲基亞砜(美國Sigma公司)，多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)，XDZ-2型倒置顯微鏡(重慶精密儀器廠)，EPICS-XL4流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，3K15臺式冷凍離心機(美國Sigma公司)，CO2培養箱(美國Thermo Forma公司)，Leica凝膠成像系統(德國Leica公司)，超凈工作臺，無菌培養瓶，乙醇等。

1.3臍帶間充質干細胞的分離、培養于無菌條件下取剖宮產新鮮臍帶，長約10 cm，用生理鹽水沖洗掉臍帶中殘留血液，將其剪成長2～3 cm的多個小段，然后再次漂洗，在超凈工作臺上縱向剖開臍帶，用組織鑷剔除2條臍動脈、1條臍靜脈，采集血管與血管之間、血管與外膜之間的凝膠狀物即華通膠組織，將其撕成細條狀。用眼科剪將剝離的華通膠組織剪碎成1～2 mm3的小組織塊，平鋪至細胞培養瓶中，然后加入含有體積分數10%的胎牛血清、100 IU/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養液，放入5%CO2、37 ℃的培養箱中靜置培養，利用新生細胞的貼壁生長特性進行分離培養。倒置顯微鏡每天觀察貼壁組織周圍細胞的生長情況，根據細胞生長情況3～4 d換液1次。當細胞從組織塊中爬出，并且細胞生長至80%～90%融合時，以吸管吹打貼壁細胞，用胰蛋白酶/EDTA消化液進行消化，并在顯微鏡下控制消化時間，PBS沖洗，離心，以1∶3進行傳代培養。

1.4臍帶間充質干細胞的凍存及復蘇細胞凍存：取培養的第3代細胞，待生長至80%～90%融合時，常規胰酶消化細胞，PBS緩沖液洗滌3次，離心去除上清，緩慢加入凍存保護劑(體積分數為20%胎牛血清+70%DMEM/F12培養液+10%二甲基亞砜)重懸細胞，進行梯度凍存，先置入4 ℃冰箱20～30 min，-20 ℃冰箱1 h，然后置入-80 ℃冰箱過夜，第2天轉入-196 ℃液氮罐中保存。細胞復蘇：凍存6個月后從液氮中取出凍存管，立即投入37 ℃水浴箱中快速融化解凍，PBS洗滌，離心，向其加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，混懸后置入培養瓶中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞達80%～90%融合后，常規胰酶消化，1∶3傳代進一步細胞擴增。

1.5凍存前后細胞的形態學觀察在倒置顯微鏡下連續觀察凍存前細胞以及凍存復蘇后細胞的形態學變化，并隨機選取視野照相，記錄觀察結果。

1.6凍存前后細胞存活率的計算對未凍存的第3代細胞和凍存復蘇后的細胞懸液分別用臺盼藍染色，滴至細胞計數板，靜置2 min，在顯微鏡下于計數板上計數著色細胞和未著色細胞(著色細胞為死細胞，未著色細胞為活細胞)，至少計數200個細胞，細胞存活率(%)=未著色細胞/(著色細胞+未著色細胞)×100%。

1.7凍存前后細胞生長曲線測定分別取未凍存的第3代細胞和凍存復蘇后的細胞，胰蛋白酶/EDTA消化，按每孔1×104個細胞接種于24孔培養板上，在5%CO2、37 ℃的培養箱中培養，每天固定時間觀察細胞生長情況，臺盼藍染色，當活細胞達到95%以上時進行細胞計數，以培養時間為橫軸、細胞數量為縱軸，繪制未凍存細胞和凍存復蘇細胞的生長曲線。

1.8凍存前后細胞的免疫表型鑒定取未凍存的第3代細胞和凍存復蘇后培養的第3代細胞，達80%～90%融合時，胰蛋白酶/EDTA消化液消化，離心，PBS制成濃度為1×106/mL的單細胞懸液，分別加入鼠抗人PE標記的CD29、CD44、CD90、CD105、CD34及FITC標記的CD45、HLA-DR單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，離心后棄去上清液，PBS洗滌2遍，重新制成細胞懸液，用流式細胞儀檢測表面抗原的表達水平，鑒定凍存前后培養的細胞是否都含有臍帶間充質干細胞的生物學標記。

1.9統計學方法數據運用SPSS 13.0軟件進行統計學處理，計數資料的比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1凍存前后臍帶間充質干細胞的形態學比較用組織塊貼壁法進行培養，在接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7～8 d后可以看到少量細胞從組織塊中爬出，呈梭形或紡錘形，之后細胞增長速度較快，培養14d左右細胞似成纖維細胞形態，呈漩渦狀生長，且平行排列，可形成片狀融合，達80%～90%，見圖1。此后可進行傳代，傳代后細胞的形態未見明顯改變，細胞生長速度加快，形成典型的漩渦狀排列生長 ，見圖2。將培養的第3代細胞凍存6個月后再復蘇，可見復蘇細胞在24 h內貼壁生長，呈紡錘形或多角形，細胞形態飽滿，生長狀態良好，待7～8 d細胞長滿瓶壁，排列有序，達到80%～90%融合，見圖3；進行1∶3傳代后的細胞生長速度加快，形態均一，生長良好，與未凍存的細胞形態基本一致。

2.2凍存前后細胞存活率比較經倒置顯微鏡觀察，未凍存的第3代細胞平均存活率為94.1%，凍存復蘇后的細胞平均存活率為92.7%，兩者平均存活率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1　原代細胞培養第14天的細胞形態(×100)

圖2　第3代細胞培養第5天的細胞形態(×100)

圖3　凍存復蘇后細胞培養至第5天的細胞形態(×100)

2.3凍存前后細胞生長曲線比較未凍存第3代細胞和凍存復蘇后細胞的生長曲線相似，均呈S型，其中前1～2 d為潛伏期，細胞無明顯增殖，自接種后第3天開始細胞生長速度增快，數量明顯增多，進入對數生長期，第7—8天細胞可達80%～90%融合，之后細胞生長停滯，進入平臺期。見圖4。

圖4　未凍存細胞和凍存復蘇后細胞的生長曲線

2.4凍存前后細胞免疫表型分析未凍存細胞與凍存復蘇后細胞均高表達基質細胞抗原CD29、CD90、CD44、CD105，低表達或不表達造血干細胞抗原CD34、CD45和白細胞相關抗原HLA-DR，說明凍存復蘇后的細胞免疫表型符合間充質干細胞的表型特征。

3討論

間充質干細胞是目前組織工程研究的熱點，其已經在心血管疾病、神經系統疾病、糖尿病、肝臟疾病、脊髓損傷等多個學科領域得到廣泛應用，對于治療一些自身免疫性疾病以及退行性病變等有很好的臨床價值，具有非常廣闊的前景。既往研究已經從骨髓、外周血、臍帶血及臍帶組織中通過不同的培養方法分離獲得了間充質干細胞，與其他來源的間充質干細胞相比，臍帶源性間充質干細胞具有如下優點：來源廣泛，采集容易，對產婦和胎兒均無任何危害，不存在法律和倫理學方面的爭議；細胞培養方法簡便，擴增能力強[10]；受病毒污染的概率低；臍帶免疫原性低，不易引起移植物抗宿主病[11]。這些優點使得臍帶間充質干細胞在組織工程領域應用日益廣泛[12]。

運用組織塊貼壁法從人臍帶華通膠中分離培養間充質干細胞，避免了酶消化法繁瑣的操作過程以及酶對細胞的毒性作用，可保持細胞良好的生物學特性，提高培養的成功率[13]。本研究結果顯示，在標準培養條件下，從臍帶華通膠提取的間充質干細胞沿培養瓶貼壁生長，呈梭形或紡錘形，漩渦狀生長，并可穩定傳代，傳代后細胞生長能力強，形態未見明顯改變；通過流式細胞儀檢測細胞的免疫表型顯示，細胞高表達間充質干細胞的表面特異抗原，幾乎不表達造血干細胞的標志性抗原，說明提取的細胞符合間充質干細胞的鑒定標準。

在細胞培養過程中，筆者也遇到一些問題，比如臍帶間充質干細胞長期培養會造成細胞衰老、分化和過剩，以及培養條件變化、培養箱故障等致使細胞污染，這些都會導致細胞、試劑和材料的浪費。既往研究已經證實骨髓源性的間充質干細胞能夠進行低溫凍存，并且凍存復蘇后仍能保持細胞的生物學特性[14-15]，因此，筆者嘗試用同樣的方法對臍帶間充質干細胞進行凍存，用來儲備細胞以備移植時使用。本研究將培養的第3代細胞放入液氮中凍存6個月，經復蘇后觀察細胞仍貼壁生長，形態未見明顯改變，同樣可以擴增、傳代培養，細胞存活率與凍存前細胞比較差異無統計學意義，均達到90%以上，而且凍存前后細胞的生長曲線相似，說明凍存復蘇后細胞增殖活性未受影響，低溫凍存沒有改變臍帶間充質干細胞的生物學特性。進一步用流式細胞儀檢測凍存復蘇后細胞的免疫表型，結果顯示凍存后細胞仍保留間充質干細胞表面抗原的特性。

綜上所述，低溫凍存可以作為長期保存臍帶間充質干細胞的一種有效方法，經凍存復蘇后的細胞保持了原有細胞的生物學特性，符合間充質干細胞的基本要求，滿足了人們對種子細胞的需求，使得臍帶間充質干細胞在組織工程研究及臨床應用中更加方便和廣泛。

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[作者簡介]韓華，女，主治醫師，碩士，主要從事婦產科干細胞移植修復方面的研究。

[基金項目]河北省衛生廳青年科技課題(20150122)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.23.002

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)23-2512-04

[收稿日期]2016-04-30

Effects of cryopreservation and resuscitation on the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells

HAN Hua, ZHAO Jing, ZHAO Hongwei, LI Jie, YAN Ping

(Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China)

Abstract:Objective It is to observe the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells after cryopreservation, and identify whether it has the characteristic of mesenchymal stem cells. Methods By tissue explants adherent method, the MSCs were isolated and cultured from umbilical cord. And the third passage cells were frozen and thawed after six month. Then the morphological changes before freezing and frozen thawed cells were observed, the survival rate was compared, the cell growth curve was determined, and the expression of cell surface antigen was detected by flow cytometry. Results MSCs were successfully obtained from Wharton’s jelly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence. After cryopreservation, the cells still maintained the characteristics of adherent growth, and the morphology did not change significantly. The survival rate of frozen thawed cells had no significant difference compared with that of the non frozen cells. Cell growth curve was similar before and after cryopreservation. The flow cytometry analysis showed that frozen thawed cells highly expressed CD29, CD90, CD44, CD105 of stromal cell antigen, but low expression of hematopoietic stem cell associated antigens CD34, CD45 and leukocyte antigen HLA-DR. Conclusion The biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells were not significantly changed after cryopreservation, and the cells were in accordance with the basic requirements of mesenchymal stem cells after cryopreservation.

Key words:mesenchyma stem cells; umbilical cord; cryopreservation; biological characteristics