三七總皂苷對腦出血大鼠神經功能及腦含水量的影響

趙雪松　樊永平　陳志剛　高　芳

(1 首都醫科大學附屬北京天壇醫院中醫科,北京,100050; 2 北京中醫藥大學第二附屬醫院東方醫院神經內科,北京,100078)

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三七總皂苷對腦出血大鼠神經功能及腦含水量的影響

趙雪松1樊永平1陳志剛2高芳2

(1 首都醫科大學附屬北京天壇醫院中醫科,北京,100050; 2 北京中醫藥大學第二附屬醫院東方醫院神經內科,北京,100078)

目的:研究三七總皂苷對腦出血大鼠神經功能及腦含水量的影響。方法:實驗用健康Sprague-Dawley(SD)同系雄性大鼠350只,體重230～250 g,大鼠隨機分為假手術組(簡稱CG),模型組(簡稱MG),用藥組(簡稱TG)3個組,每組分6 h、24 h、48 h、72 h、7 d,5個時間點。造模用Ⅳ型膠原酶注入尾殼核,治療組給予三七總皂苷腹腔注射,1次/d。在相應時間點,采用改良的神經功能缺損評分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)對各時間點神經功能缺損進行評價。結果:各時間點MG mNSS和CG比明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)，除6 h外,各時間點MG和TG比,TG mNSS明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。各時間點MG腦含水量和CG比明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05)，除6 h、7 d外,各時間點MG和TG比,TG腦含水量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。結論:腦出血模型組中,6 h開始,mNSS和腦含水量明顯增高,到48 h達到高峰,以后逐漸下降,三七總皂苷可以明顯下調 mNSS評分和腦含水量。

三七總皂苷;腦出血;神經功能;腦含水量

腦出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)是最危重的一種卒中類型,占所有卒中事件10%～25%[1]。ICH的病死率明顯高于缺血性卒中,直接病死率為38%～43%,病殘率為70%～80%,其復發率約為1.8%～11%[2-3]。ICH具有發病急、變化快、病情危重、病機復雜等特點,臨床必須緊急救治,故急性期救治對提高搶救成功率和患者的生活質量具有重要意義。目前關于ICH急性期的治療無突破性的進展,尤其是內科治療,多限于脫水降顱壓、調整血壓、改善營養代謝和防治并發癥等對癥及支持療法,缺乏針對性強、有效的治療手段,多數ICH患者都留下神經功能缺損。ICH后腦損傷的機制很多,包括血腫的擴大、血腫周圍組織缺血(缺血性半暗帶)、血腫周圍組織腦水腫等,在血腫形成過程中和形成后,都存在腦水腫,腦水腫具有神經毒性,破壞神經的正常功能[4]。本研究通過三七總皂苷對腦出血大鼠神經功能評分及腦含水量的影響,探討其對腦出血的治療作用。

1　材料與方法

1.1試劑與動物模型的制備

1.1.1實驗動物與分組實驗用健康Sprague-Dawley(SD)同系雄性大鼠350只,體重230～250 g,動物許可證號是SCXK(京)2012-0001,實驗動物全部從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買。動物每籠10只群養,飼養于普通級動物房,室內溫度保持為(22±2)℃,相對濕度保持為30%～40%。各組大鼠常規飼料,自由進食飲水。

1.1.2主要實驗設備及試劑立體定位儀(Model310),日本stoelting公司,Ⅳ型膠原酶,sigma公司,貨號C-5138,三七總皂苷,廣西梧州制藥集團股份有限公司,電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9145A型),上海一恒科技有限公司,離心機(Eppendorf Centrifuge 5810R),德國EPPENDORF公司,微量進樣器,上海安亭器械廠,水合氯醛(批號20111024),國家集團化學試劑有限公司,精密電子天平(1/1000,A2005),Saitorius公司,超低溫冰箱(MDF-U32V),SANYO公司。

1.1.3動物模型制作及給藥腦出血大鼠動物模型參考了Rosenberg等提出的方法進行制備。術前準備:首先大鼠在造模前8 h采取禁食和禁水措施,其次把配置好的麻藥(10%水合氯醛)、手術器械、立體定位儀、冰塊、藥品等準備好,最后用醫用生理鹽水洗滌微量進樣器數遍,直到管壁光滑,針頭沒有存留雜物。造模過程:1)稱重,然后按每100 g體重0.4 mL的比例腹腔注射麻醉,麻藥給藥后,大約5～10 min麻醉完成。2)給實驗大鼠頭部備皮,沿頭顱正中部切開皮膚,向左右分開皮膚,用棉球擦掉骨膜,如出血,按壓止血,充分暴露前囪,接著用微量進樣器抽取配置好的膠原酶溶液(每1 μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U),把微量進樣器和大鼠分別固定于立體定位儀上。3)參照大鼠腦立體定位圖譜,右側尾殼核體表位于前囟右3 mm后1 mm處,微量進樣器針頭對準前囟,調節旋鈕,向后移動3 mm,向后移動1 mm,記號筆標記此點,然后用顱骨鉆鉆開顱骨,再向下移動5.5 mm,啟動微量進樣器,把2 μL膠原酶勻速緩慢打入尾殼核(模型組和用藥組老鼠),假手術組則用微量進樣器打入2 μL滅菌生理鹽水,留針5 min,緩慢退出微量進樣器,切口撒適量青霉素鉀粉,縫合傷口回籠飼養。

本實驗采用的藥物是三七總皂苷的成品藥物血栓通針粉,各組實驗大鼠分為6 h,24 h,48 h,72 h,7 d,5個時間點,給藥根據時間點的不同而不同。生理鹽水和血栓通針粉都通過腹腔注射給藥,生理鹽水給藥量為每100 g體重1 mm,血栓通給藥量為每100 g體重0.72 mL,配置時溶液中含有10 mg/mL血栓通。6 h時間點的假手術組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,6 h后取材。24 h時間點的假手術組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后取材。48 h時間點的假手術組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,造模后48 h取材。72 h時間點的假手術組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,48 h后各組再注射1次,造模后72 h取材。7 d時間點的假手術組和模型組大鼠于造模完成后立即按體重腹腔注射生理鹽水,用藥組按體重立即腹腔注射血栓通,24 h后各組再注射1次,48 h后各組再注射1次,72 h后各組再注射1次,4 d后各組再注射1次,5 d后各組再注射1次,6 d后各組再注射1次,造模后7 d取材。

表1　改良的神經功能缺損評分表

1.2實驗方法

1.2.1mNSS評分神經功能改良的神經功能缺損評分(Modified Neurological Severity Score,mNSS)評定神經功能。將每組各時間點大鼠在相應時間點做mNSS評分,mNSS是目前國際上公認的大鼠腦卒中后神經功能缺失評判標準,主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動。最大得分為18分,缺少一項反射或動物不能完成一項任務給1分,輕型傷:1～6分;中型傷:7～12分;重型傷:13～18分。評定指標及方法見表1。

1.2.2腦含水量測定于相應時間點麻醉大鼠后,斷頭取腦,立即稱重并記錄每只大鼠鼠腦的濕重,用錫箔紙包裹,并標號,然后放入-70 ℃冰箱凍存,集中放入110 ℃恒溫箱中烘干至恒重,24 h后取出立即稱取干重。

2　結果

2.1mNSS評分測定假手術組注射生理鹽水對大鼠腦組織有損傷,動物干預后會存在短時的神經功能障礙,24 h時神經功能恢復正常;腦出血組神經功能評分較高,在48 h時神經功能缺失最重,同假手術組比較,差異有統計學意義(P<0.05);治療組運動、感覺、平衡以及反射4個方面缺失程度減輕,mNSS神經功能評分明顯低于腦出血組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1。

2.2腦含水量測定腦含水量按Billiot公式計算,腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。與假手術組比較,模型組各時間點腦含水量變化明顯,差異有統計學意義(P<0.05)，模型組腦含水量6 h開始升高,48 h達到高峰,以后逐漸下降。除6 h、7 d外,其余各時間點模型組和用藥組比較,用藥組腦含水量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表2　三七總皂苷干預腦出血大鼠后mNSS評分的變化±s)

注:假手術組簡稱CG;模型組簡稱MG;用藥組簡稱TG;相應時間點與假手術組比較,*P<0.05,與模型組比較,△P<0.05。

表3　三七總皂苷干預腦出血大鼠后腦含水量的變化±s,%)

注:假手術組簡稱CG;模型組簡稱MG;用藥組簡稱TG;相應時間點與假手術組比較,*P<0.05,與模型組比較,△P<0.05。

圖1　三七總皂苷干預腦出血大鼠后mNSS評分的變化

注：相應時間點與假手術組比較,△P<0.05,與模型組比較,*P<0.05。

圖2　三七總皂苷干預腦出血大鼠后腦含水量的變化

注：相應時間點與假手術組比較,△P<0.05,與模型組比較,*P<0.05。

3　討論

ICH后的神經損害主要分為兩方面,其一是血腫擴大及占位效應引發的原發性損傷,其二是腦水腫,炎性反應所致的繼發性神經損傷,原發性損傷往往不可逆,繼發性損傷是可以減輕的。腦出血后腦水腫和炎性反應是繼發性腦損傷的主要原因,研究發現凝血酶在繼發性腦損傷中扮演著重要角色,它與par-1、NMDANR、MMP-9和NF-κB相互作用,誘發腦水腫和炎性反應,加重腦損傷。腦出血后血腫壓迫微循環引起的周圍組織缺血、缺氧[5],凝血酶激活,進一步破壞血腦屏障完整性,白細胞在腦組織中聚集并誘導某些活性物質如MMP-9、TNF-α釋放[6],興奮性氨基酸與細胞的特異性受體相結合,引起細胞能量需求增加等都可以誘發加重腦水腫[7]。腦出血屬于中醫學的中風病,其基本病理演變為瘀血阻滯,脈絡不暢,日久化毒;毒留脈內,日久化火,灼傷脈絡,或毒邪傷絡,血溢成瘀,或毒邪傷津,血滯為瘀,瘀毒互彰,毒損腦髓,髓損神傷,終致神明受擾,神機失用,昏蒙昏饋,病機根本在于瘀血,治以活血化瘀,藥物選用中藥三七的提取物血栓通凍干粉,三七味寒、微苦,性溫,入肝、胃、大腸經,具有止血散瘀,消腫定痛的功效,止血而不留瘀。三七的活性成分為三七總皂苷,主要用于中樞神經系統、心血管系統、血液系統疾病,并有抗炎、改善腎功能等作用,可促進腦出血顱內血腫的吸收、減輕腦水腫和炎性反應、清除自由基、改善血腫周圍微循環、降低血腦屏障通透性以治療出血性中風,促進腦出血后神經元的存活及損傷修復。

造模后,對實驗動物各時間點神經功能缺損進行評價,假手術組注射生理鹽水對大鼠腦組織有損傷,實驗干預后會存在短時的神經功能障礙,24 h時神經功能恢復正常;腦出血組神經功能評分較高,6 h開始到48 h逐漸升高,在48 h時達到峰值,神經功能缺損最重,以后緩慢下降,模型組與假手術組比較,5個時間點均有差異統計學意義(均P<0.05),佐證了模型制作成功,說明腦出血發生后,神經功能很快出現缺損,6 h即可見,變化呈先升后降趨勢,在48 h時達峰值。用藥組經治療后,運動、感覺、平衡以及反射4個方面神經功能缺失程度減輕,用藥組與模型組比較,神經缺損評分比相應時間點模型組都下降,除6 h組下降較小,差異無統計學意義外(P=0.228),其余各組神經功能缺損評分較相應時間點模型組差異均有統計學意義(均P<0.05),6 h組無統計學意義(P>0.05)可能是由于藥物沒有充分發揮作用所致,但是依據均值來看,用藥組比模型組下降,說明治療還是有效果的。其余各組mNSS評分明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05),說明三七總皂苷對于減輕大鼠腦出血后神經功能缺損是有效的,為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實驗依據。

采用Billiot公式計算腦含水量,腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%,假手術組注射生理鹽水對大鼠腦組織造成損傷,出現輕度的腦水腫,隨著時間的推移,基本呈減輕趨勢,在1周的時候減到最小。模型組大鼠腦含水量呈先升高后下降趨勢,在造模后6 h即出現腦水腫,以后急速升高,在48 h達到頂峰,從72 h開始逐漸下降,7 d時基本接近正常。假手術組和模型組比較,各時間點差異有統計學意義(P<0.05),說明腦出血后腦水腫是一個非常普遍而且重要的變化,它對神經功能產生了重大影響,也是我們關注的重點。用藥治療后,各時間點腦水腫都減輕,用藥組與模型組比較,6 h時間點雖然有下降,但是差異無統計學意義(P=0.062),原因可能是由于藥物還沒有充分發揮作用,但是據實驗數據來看,用藥組比模型組下降,說明治療還是有效果的。24 h、48 h、72 h,3個時間點的模型組和用藥組比較,差異有統計學意義(P<0.05)。7 d組用藥組與模型組比較,雖然腦水腫有所減輕,但是差異無統計學意義(P=0.41),究其原因可能是第7天時,腦水腫原本就自發的緩解了,從實驗數據來看,用藥后對腦水腫起了下調作用,說明治療是有效的。總的來說,三七總皂苷對腦出血后腦水腫有治療作用,為臨床活血化瘀藥治療腦出血提供實驗依據。

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(2016-03-31收稿責任編輯：王明)

Panax Notoginseng Saponins′s Effect on Nerve Function and Cerebral Edema of Rats with Cerebral Hemorrhage

Zhao Xuesong1, Fan Yongping1, Chen Zhigang2, Gao Fang2

(1ChineseMedicineDepartment,BeijingTiantanHospitalaffiliatedCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China;2NeurologyDepartment,DongfangHospitalBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To investigate the effects of Panax Notoginseng Saponins (PNS) on the neurological function and cerebral water content in the rats with cerebral hemorrhage. Methods: A total of 350 healthy homologous male SD rats, 230～250 g, were randomly divided into control group, model group and treatment group, and were observed at the following time points: 6 h, 24 h, 48 h, 72 h and 7days respectively. Rats model was established by Ⅳ collagenase type uniform slowly into the tail putamen hemorrhage. The treatment group were given intraperitoneal injection of PNS once a day. The Modified Neurological Severity Score (mNSS) of each group at the same time points was used to evaluate the nerve damage. Results: The mNSS of model group was significantly higher at every time point than the control group (P<0. 05). Except for 6 h, the mNSS of treatment group was significantly higher at the other time points than the other two groups (P<0. 05). The brain water content of the model group was significantly higher at every time point than the control group (P<0. 05). Except for the 6 h and 7d time point, the brain water content of the treatment group was significantly lower than the other two groups (P<0. 05). Conclusion: In the cerebral hemorrhage model groups, the mNSS and brain water significantly increased at 6 h, reached a peak at 48 h, then gradually declined. PNS can significantly decrease the mNSS scores and brain water content.

Panax Notoginseng Saponins; Cerebral hemorrhage; Nerve function; Brain water content

北京市中醫藥科技項目(編號:QN2014-17);首都醫科大學附屬北京天壇醫院青年科研基金(編號:2014-YQN-YS-06)

趙雪松(1981.03—),男,醫學博士,住院醫師,研究方向:中醫內科腦病,E-mail:65835337@qq.com

樊永平(1965.01—),男,醫學博士,主任醫師,科主任,研究方向:中醫治療腦病臨床和研究，Tel:(010)67096662,E-mail:yongpingf@hotmail.com

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.042