液基細(xì)胞學(xué)、HPV-DNA及hTERC基因聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值

趙潤(rùn)珍山西省汾陽(yáng)醫(yī)院病理科，山西汾陽(yáng)　032200

液基細(xì)胞學(xué)、HPV-DNA及hTERC基因聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值

趙潤(rùn)珍
山西省汾陽(yáng)醫(yī)院病理科，山西汾陽(yáng)032200

目的 探討TCT、HPV-DNA及hTERC基因聯(lián)合檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用價(jià)值。 方法 對(duì)480例篩查者分別進(jìn)行TCT、HPV-DNA和hTERC基因檢測(cè)，并以病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三種檢查方法的敏感度、特異度及符合率進(jìn)行分析。結(jié)果480例受檢者中，TCT檢測(cè)異常49例，HPV陽(yáng)性54例，hTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性29例。單一篩查時(shí)，TCT靈敏度最高，hTERC特異度和符合率最高；聯(lián)合篩查時(shí)，TCT+HPV（+）靈敏度最高，HPV+ hTERC（+）特異度和符合率最高，單項(xiàng)篩查和聯(lián)合篩查的檢出率均與病理級(jí)別有關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 聯(lián)合檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查中，優(yōu)勢(shì)較為明顯，其中以HPV-DNA聯(lián)合hTERC基因檢測(cè)效果最為理想，檢查結(jié)果均與宮頸高級(jí)別病變存在密切的關(guān)系。

宮頸癌；HPV-DNA；hTERC基因；聯(lián)合檢測(cè)；早期診斷

［Abstract］Objective To study the application value of combined detection of TCT，HPV-DNA and hTERC genes in screening of cervical cancer.Methods 480 subjects were examined by TCT testing，HPV-DNA and hTERC genes detection.The sensitivity，specificity and coincidence rate of the three methods were studied with the results of pathological examination as the reference standard.Results In 480 subjects，abnormalities were found in 49 cases by using TCT testing，further，54 cases were HPV-positive，and amplification positive PCR product of hTERC gene were detected in 29 cases.Single-arm screening results indicated that TCT had the highest sensitivity，and hTERC had the highest specificity and coincidence rate；by combined screening，the sensitivity of TCT+HPV（+）was the highest，while the HPV+hTERC（+）had the highest specificity and coincidence rate.Both single-arm screening and combined screening were correlated with histological grades，with statistical significance（P＜0.05）.Conclusion Combined examination has a remarkable advantage for the screening of cervical cancer over the single-arm screening，and the detection effect of HPV-DNA combined with hTERC gene is most evident.Besides，the inspection results are closely correlated the high levels of cervical lesions.

［Key words］Cervical cancer；HPV-DNA；hTERC gene；Combined detection；Early diagnosis

宮頸癌（cervical cancer，CC）是臨床上常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，我國(guó)每年大約近3萬(wàn)人死于宮頸癌［1-3］，早期診斷對(duì)癌前病變的篩查和治療及預(yù)防有著非常重要的意義，采用有效的檢查方法是提高宮頸癌早期診斷正確率的關(guān)鍵，目前篩查宮頸癌已成為研究的熱點(diǎn)［4］。隨著宮頸細(xì)胞學(xué)在臨床上得以廣泛應(yīng)用，如液基細(xì)胞學(xué)（TCT）、人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和染色體端粒酶（hTERC）基因檢測(cè)等［5］，使得癌前病變的及早發(fā)現(xiàn)和早期治療取得了很大的進(jìn)展，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均得到明顯下降［6］。hTERC基因檢測(cè)是TCT和 HPV檢測(cè)方法的有力補(bǔ)充，三者聯(lián)合有助于宮頸癌早期診斷和治療后隨訪。本研究選取我院2013年4月～2014年12月期間接收的480例行宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查者作為研究對(duì)象，現(xiàn)將TCT、HPV-DNA及hTERC基因聯(lián)合檢測(cè)應(yīng)用于宮頸癌篩查中的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

以我院2013年4月～2014年12月期間接收的480例篩查者作為研究對(duì)象，均有性生活史，年齡24～61歲，平均（42.6±5.3）歲，排除存在宮頸活檢和手術(shù)、上皮內(nèi)瘤變和生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病史以及妊娠期間和哺乳期的婦女。

1.2儀器與試劑

本組研究均在篩選者知情下進(jìn)行，所有儀器有離心機(jī)（包括冷凍高速離心機(jī)、八連管離心機(jī)和自動(dòng)平衡離心機(jī)）、自動(dòng)制片機(jī)、微量加氧槍、渦旋振蕩器、電熱恒溫水浴箱和培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡等；試劑除hTERC和HPV檢測(cè)試劑盒外，固定液和乙醇均自行配制，包括甲醇冰醋酸、甲醛固定液和不同劑量乙醇（75%、85%、100%）。

1.3方法

擦除宮頸表面分泌物后，以液基細(xì)胞毛刷取得柱狀細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞間細(xì)胞，對(duì)樣本同時(shí)行TCT、HPVDNA、hTERC基因檢測(cè)，避開(kāi)月經(jīng)期，若在采集過(guò)程中出現(xiàn)出血情況，應(yīng)擦拭干凈后再行采集，提前2 d通知篩選者，不可盆浴、陰道沖洗、有性行為以及自行用藥，樣本在4℃溫度下保存，不能超過(guò)1周［7］。具體檢測(cè)內(nèi)容為：①TCT檢查。按照TBS分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，明確WNL、ASC、AC、AG、SCC、LSIL、HSIL等內(nèi)容，采用自動(dòng)制片機(jī)制片，酒精固定后行巴式染色，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析。②HPV-DNA檢測(cè)。采用SPR法，取樣本1 mL，離心5 min，設(shè)置為12000轉(zhuǎn)/min，DNA提取純化，保存時(shí)應(yīng)避免反復(fù)凍融；將PCR反應(yīng)體系按照90 μL劑量置入擴(kuò)增管中，加入樣本DNA模板，混勻后配置擴(kuò)增體系，依據(jù)指定程序完成擴(kuò)增；將變性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，啟動(dòng)SPR檢測(cè)程序，置入HPV生物傳感芯片，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及探針的信號(hào)值進(jìn)行判讀。③hTERC基因檢測(cè)。采用EISH技術(shù)，將樣本置入離心管中，離心10 min，設(shè)置為1500轉(zhuǎn)/min，酶消化和低滲各30 min，離心前后分別加入2 mL、5 mL固定液，最后重復(fù)固定2次，玻片制備，并對(duì)其分別進(jìn)行75%、85%、100%乙醇預(yù)處理，將配置好的變性探針混合液進(jìn)行變性雜交，時(shí)間為16 h；復(fù)染，觀察細(xì)胞核熒光雜交信號(hào)，以紅、綠信號(hào)各為2個(gè)為正常，反之則為存在基因擴(kuò)增，以正常檢查者為對(duì)照，設(shè)定閾值，若擴(kuò)增異常細(xì)胞比例高于閾值，提示為陽(yáng)性，反之，則為陰性［8］。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS12.5軟件包對(duì)收錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)聯(lián)合檢測(cè)的敏感度、特異度進(jìn)行分析，并計(jì)算假陰、假陽(yáng)和符合率，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三種檢測(cè)結(jié)果和活檢病理結(jié)果

480例受檢者中，TCT檢測(cè)異常49例（占10.2%，49/480），不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）（圖1）、不典型腺細(xì)胞（AGC）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）分別為41例、4例、3例、1例；HPV陽(yáng)性54例（占11.3%，54/480），高危型感染和低危型感染分別為47例7例，其中單一型32例，2種以上型22例；hTERC基因擴(kuò)增陽(yáng)性29例（6.0%，29/480），檢測(cè)閾值為5。宮頸活檢64例，其中正常范圍（WNL）54例（占84.4%，54/64），鱗狀上皮內(nèi)瘤樣病變（Cervical intraepithelial neoplasia，CIN）10例（占15.6%，10/64），按輕、中、重度不典型增生及病變累及的范圍分3級(jí)：輕度不典型增生，即病變累及鱗狀上皮下1/3（CINⅠ級(jí)，圖2）；中度不典型增生，即病變累及鱗狀上皮的下2/3（CINⅡ級(jí)，圖3）；重度不典型增生，即病變累及宮頸鱗狀上皮全層（CINⅢ級(jí)，圖4）。HE×100。TCT檢測(cè)異常及宮頸活檢宮頸上皮內(nèi)瘤變光鏡觀察見(jiàn)圖1～4。

圖1　TCT診斷為ASC-US（HE×100）

圖2　宮頸活檢CINⅠ級(jí)（HE×100）

圖3　宮頸活檢CINⅡ級(jí)（HE×100）

圖4　宮頸活檢CINⅢ級(jí)（HE×100）

2.2診斷性試驗(yàn)結(jié)果及與病理診斷結(jié)果之間的關(guān)系

單一篩查方法中，靈敏度從高到低排列依次為T(mén)CT、HPV、hTERC，分別為82.9%、74.8%、64.1%；特異度從高到低排列依次為 hTERC、TCT、HPV，分別為82.0%、54.0%、54.0%；假陰性率從高到低排列依次為hTERC、HPV、TCT，分別為36.2%、25.5%、16.8%；假陽(yáng)性率從高到低排列依次為HPV、TCT、hTERC，分別為56.8%、46.2%、18.0%；符合率從高到低排列依次為hTERC、TCT、HPV，分別為79.2%、59.0%、48.5%。

聯(lián)合篩查中，靈敏度從高到低排列依次為T(mén)CT+ HPV、TCT+hTERC、HPV+hTERC，分別為94.5%（453/ 480）、89.0%（427/480）、86.2%（414/480）；特異度從高到低排列依次為HPV+hTERC、TCT+hTERC、TCT+ HPV，分別為86.6%（416/480）、80.2%（385/480）、30.2% （145/480）；假陰性率從高到低排列依次為HPV+hTERC、TCT+hTERC、TCT+HPV，分別為14.0%（67/480）、11.2% （54/480）、5.8%（28/480）；假陽(yáng)性率從高到低排列依次為T(mén)CT+HPV、TCT+hTERC、HPV+hTERC，分別為70.5% （338/480）、20.2%（97/480）、13.5%（65/480）；符合率從高到低排列依次為HPV+hTERC、TCT+hTERC、TCT+ HPV，分別為86.4%（415/480）、81.8%（393/480）、40.0% （192/480）。見(jiàn)表1。

表1　診斷性試驗(yàn)結(jié)果及與病理診斷結(jié)果比較

無(wú)論是單項(xiàng)篩查還是聯(lián)合篩查，檢出率均隨著病理級(jí)別的升高而逐漸升高，不同病理級(jí)別檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明三項(xiàng)檢查均與宮頸高級(jí)別病變存在密切的關(guān)系。

3　討論

宮頸癌（CC）是婦科最為常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，與高危型HPV持續(xù)感染直接相關(guān)，從慢性宮頸炎、宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN）直至進(jìn)展演變成為宮頸鱗癌是一種多因素共同作用的復(fù)雜病理過(guò)程［9］，探明宮頸鱗癌癌變過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制及其相關(guān)影響因素，能為宮頸癌的早發(fā)現(xiàn)，治療提供有價(jià)值的幫助［10］。由于CC患者在發(fā)病初期并無(wú)明顯癥狀和體征，并未引起注意，宮頸外觀并無(wú)明顯異常，在臨床檢查過(guò)程中漏診和誤診情況也時(shí)有發(fā)生，多數(shù)患者病變?cè)\斷后癌癥已經(jīng)發(fā)展到中晚期，給治療帶來(lái)了很大難度，生命安全受到嚴(yán)重威脅［11］。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的的發(fā)展，細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)技術(shù)取得了巨大進(jìn)展，新的報(bào)告方式TBS及采用描述性診斷和滿意度評(píng)估，逐漸替代傳統(tǒng)的巴氏分類(lèi)法［12］。

在臨床工作中，HPV靈敏度較TCT高。HPVDNA靈敏度達(dá)97%，而TCT特異性達(dá)87%。我們的體會(huì)：①HPV-DNA靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值，可回歸到正常人群管理；②HPV-DNA目的是發(fā)現(xiàn)真正高風(fēng)險(xiǎn)人群而非單純HPV感染。③若TCT（-），HPV（+），每年要重復(fù)篩查；應(yīng)視為細(xì)胞學(xué)漏診，漏診者中約1/3，HPV16/18（+），關(guān)于HPV16（+），每8例就有一個(gè)漏診，它發(fā)生CINⅡ以上的機(jī)率為13.6%，HPV18（+）發(fā)生CINⅡ以上的風(fēng)險(xiǎn)為7%。④HPV（+），檢測(cè)不同級(jí)別CIN，早期發(fā)現(xiàn)HSIL。HPV（+）發(fā)生CIN1機(jī)會(huì)高3.8倍，發(fā)生CIN2-3的機(jī)會(huì)高12.7倍。

hTERC該基因的異常擴(kuò)增可能是宮頸癌形成的早期事件，hTERC基因的陽(yáng)性表達(dá)率隨著細(xì)胞學(xué)分級(jí)的遞增而增加且與高危型HPV的持續(xù)感染密切相關(guān)，hTERC與TCT兩者聯(lián)合檢出宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及鱗癌的比率高于單獨(dú)使用TCT檢測(cè)的比率。hTERC基因擴(kuò)增可能促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展，與病變程度呈正相關(guān)。本文結(jié)果顯示hTERC基因可作為宮頸癌的生物學(xué)標(biāo)志，用于宮頸癌的篩查，早期診斷與文獻(xiàn)報(bào)道一致［13-15］。

TCT、HPV-DNA和hTERC基因檢測(cè)現(xiàn)已成為CC篩查的主要檢查方法，但是單項(xiàng)篩查效果仍不十分理想，為進(jìn)一步提高CC病變的檢出率，聯(lián)合篩查方案在臨床上得以廣泛應(yīng)用，其效果也獲得了充分的肯定，研究顯示，不同檢查結(jié)果均與宮頸高級(jí)別病變存在密切的關(guān)系，其中以HPV-DNA聯(lián)合hTERC基因檢測(cè)效果最為理想，建議作為首選篩查方案，在臨床上加以推廣。

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The application value of combined detection of TCT，HPV-DNA and hTERC genes in screening of cervical cancer

ZHAO Runzhen
Department of Pathology，F(xiàn)enyang Hospital of Shanxi Province，F(xiàn)enyang032200，China

R737.3

A

1673-9701（2016）17-0009-04

（2016-04-28）