異鉤藤堿通過mTOR非依賴性途徑誘導SH-SY5Y細胞自噬發生

徐　妍　嚴　旺　蔡雅衛　王繼業.寧波市第二醫院老年醫學科，浙江寧波　500；2.寧波市第二醫院神經內科，浙江寧波　500；.浙江警察學院，浙江杭州　005

異鉤藤堿通過mTOR非依賴性途徑誘導SH-SY5Y細胞自噬發生

徐妍1嚴旺2▲蔡雅衛1王繼業3
1.寧波市第二醫院老年醫學科，浙江寧波315010；2.寧波市第二醫院神經內科，浙江寧波315010；3.浙江警察學院，浙江杭州310053

目的 探討異鉤藤堿（Isorhynchophylline，IRN）人膠質瘤細胞SH-SY5Y細胞自噬的發生及其與mTOR信號通路的關系。方法 用不同濃度IRN（6、12和24 μmol/L）處理SH-SY5Y細胞24 h，免疫印跡法檢測自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ的表達，免疫熒光法觀察微管相關蛋白輕鏈3（LC3）熒光斑點標記的自噬體形成，利用溶酶體穩定劑氯喹（CQ）以及自噬抑制劑3-MA進一步明確IRN作用的途徑。Western蛋白印跡法檢測mTOR相關蛋白和Beclin1的表達。結果IRN作用SH-SY5Y細胞24 h后，可顯著上調LC3-Ⅱ表達，0、6、12、24 μM IRN作用后的相對表達量分別為（0.086±0.02）、（0.39±0.14）、（0.96±0.09）、（1.93±0.14）。自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高（P＜0.01），并呈濃度依賴性，SH-SY5Y細胞內GFP-LC3熒光斑點標記的自噬體增多，在IRN不同濃度處理組（0、6、12、24 μM）中分別為2±1/細胞，4±1/細胞，8±1/細胞，和14±2/細胞。IRN聯合CQ后可以促進LC3-Ⅱ的表達 （0.64±0.052）。IRN可以削弱a-Syn蛋白表達，在0、6、12、24 μM組中的相對表達量為 （0.71±0.07）、（0.69± 0.05）、（0.53±0.04）、（0.36±0.034），并呈濃度依賴性，聯合3-MA后a-Syn表達上調（0.63±0.04），提示3-MA可以逆轉由IRN對a-Syn的抑制效果，而CQ對a-Syn表達，與對照組比無顯著影響。信號通路研究提示，對mTOR以及Beclin1表達不影響，Beclin1特異性siRNA作用后可以抑制IRN誘導的LC3-Ⅱ表達。 結論IRN可誘導SHSY5Y細胞自噬的發生，其機制為mTOR非依賴性自噬途徑，Beclin1的表達可以影響IRN誘導的自噬。

異鉤藤堿；SH-SY5Y細胞；自噬；Beclin1

［Abstract］Objective To explore the relationship between the occurrence of autophagy of human glioma cell SH-SY5Y induced by isorhynchophylline（IRN）and mTOR signaling pathway.Methods SH-SY5Y cells were treated by IRN with different concentrations（6，12 and 24 μmol/L）for 24h，and Western Blot method was used to test the expression of marker protein of autophagy LC3-Ⅱ.Immumofluorescence method was used to observe the formation of autophagosome marked by fluorescent spots in microtubule-associated protein LC3.Lysosome stabilizer CQ，and autophagy inhibitor 3-MA were used to further identify the action pathway of IRN.Western Blot method was used to test the expression of mTOR-associated proteins and Beclin1.Results After SH-SY5Y cells were treated by IRN，the expression of LC3-Ⅱwas significantly up-regulated.The relative expression amount after the action of 0，6，12 and 24 μM IRN was（0.086± 0.02），（0.39±0.14），（0.96±0.09），and（1.93±0.14）respectively.The ratio of autophagy-associated proteins LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas increased（P＜0.01），showing concentration dependence.Autophagosome marked by GFP-LC3 fluorescent spots were increased in SH-SY5Y cells，and was 2±1/cell，4±1/cell，8±1/cell and 14±2/cell respectively in the IRN treatment groups with different concentrations（0，6，12，24 μM）.IRN combined with CQ was able to promote the expression of LC3-II（0.64±0.052）.IRN was able to reduce the expression of a-Syn protein.The relative expression amount in 0，6，12 and 24 μM groups were（0.71±0.07），（0.69±0.05），（0.53±0.04），and（0.36±0.034）respectively，showing concentration dependence.After the combination with 3-MA，a-Syn expression was up-regulated（0.63±0.04），indicating that 3-MA was able to reverse the inhibiting effects of IRN on a-Syn.The effects of CQ on the expression of a-Syn were not sig-nificant compared with the control group.The study on signaling pathway indicated that the expression of mTOR and Becline1 was not affected，and with the action of Beclin1-specific siRNA，the expression of LC3-Ⅱinduced by IRN could be inhibited.Conclusion IRN is able to induce the occurrence of autophagy of SH-WY5Y cells，and the mechanism is independent autophagy pathway of mTOR.The expression of Beclin1 is able to affect the autophagy induced by IRN.

［Key words］Isorhynchophylline；SH-SY5Y cells；Autophagy；Beclin1

細胞自噬是常見的生物學現象，是對細胞內環境穩定的高度保守的生理過程，通過降解胞漿內細胞器，長壽命蛋白和有聚集傾向的蛋白，進而滿足細胞對物質的需求，一定意義上也是細胞在饑餓或者環境壓力下的一種自然生理過程。有多種神經退行性疾病與細胞內某些蛋白的異常聚集有關，如阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson Disease，PD）和亨廷頓病疾病屬于神經變性疾病，這些疾病的發生在一定程度上與大腦受累區域中異常蛋白的過度積聚有關。比如像a-突觸核蛋白（a-Syn）的過度表達與和家族型帕金森的發生密切相關［1］。a-Syn的點突變則可以增加其聚集傾向，并可導致家族性PD的早期發病，在小鼠的研究中同時也驗證了過量表達的a-Syn可以導致腦神經中多巴胺能神經元的喪失，以及細胞質內包涵體的形成，并最終導致進行性運動缺陷，普遍認為a-Syn寡聚體的積累或包涵體的形成會對神經元細胞產生毒性，最終可以導致神經元細胞直接死亡。此外，在老年癡呆患者中往往有Tau蛋白的過量聚集，Tau蛋白的過度磷酸化與AD發病的相關性密切［2］。目前認為，a-Syn、Tau蛋白以及其他類似的可以引起神經退行性病變的寡聚蛋白極大程度上依賴于細胞自噬途徑的清除，這些蛋白在細胞內的體積往往較大，無法通過蛋白酶體的狹窄核心進行降解。

異鉤藤堿（Isorhynchophylline，IRN）是從茜草科中藥鉤藤抽取提的具有較強藥理活性的羥吲哚生物堿，除已被臨床應用于治療心血管疾病外，近年來研究發現，其對中樞神經系統具有廣泛的藥理學作用，存在多種生物活性，比如對缺血誘導引起的神經元損傷的保護作用［3］；抑制LPS誘導的星形膠質細胞炎癥因子的釋放［4］；顯著降低大腦皮層的興奮性，具有明顯的鎮靜、安眠、降壓、解痙等作用，是安神養血口服液中的主要成分之一［5］，這些研究都從不同角度說明IRN可以較好通過血腦屏障而影響腦內神經元細胞［6］。目前尚無IRN在自噬方面的研究。本項目在2014年12月～2015年12月開展，著重考察IRN對神經膠質瘤細胞，SH-SY5Y細胞自噬的影響，探討IRN是否可誘導SH-SY5Y細胞自噬性以及相關機制分析。

1　材料與方法

1.1細胞、試劑和主要儀器

神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞庫。新生牛血清，DMEM培養基和0.25%胰蛋白酶購自美國Life technology公司；異鉤藤堿購自美國Sigma公司；mTOR通路相關抗體，美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人自噬微觀相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）抗體，p62抗體，兔抗人Beclin1抗體，以及二抗均購自Abcam；mTOR以及P70S6K磷酸化抗體購自CST公司；底物化學發光試劑，Fluor Save抗熒光淬滅劑，3-MA（3-Methyladenine）以及氯喹（CQ）均購自美國Millipore公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2細胞培養和藥物處理

SH-SY5Y細胞培養在含有10%胎牛血清以及100 U/mL青-鏈霉素霉素的DMEM培養液中，置于含有5%CO2，37℃培養箱中，每隔2～3天換液。取對數生長期細胞進行實驗。將SH-SY5Y細胞以1×104/mL密度接種于6孔或12孔板，置于培養箱中培養24 h后，IRN配置成10 mM儲液，使用時用完全培養稀釋，加入到細胞中使得終濃度分別為0、6、12和24 μM，放回培養箱孵育12～72 h用于后續的實驗。

1.3GFP-LC3斑點計數

細胞爬片后，經IRN處理的細胞用PBS漂洗一遍后，4%多聚甲醛固定15min，含0.3%TritonX-100 PBS透化10 min，羊血清封閉30 min后，加入LC3抗體（1：200），4℃孵育過夜，PBS漂洗后加入FITC標記的二抗（1∶50）室溫下避光反應1h，PBS漂洗后用Fluor Save試劑封片，熒光顯微鏡計數細胞內斑點情況。隨機選擇視野中至少50個細胞用于計數，計算斑點總數/細胞總數。

1.4免疫印跡

經不同濃度IRN處理后，冷PBS漂洗一遍，RIPA裂解細胞，收集蛋白并用BCA法測定蛋白濃度。按20 μg/泳道蛋白量進行SDS-PAGE電泳，轉膜并用脫脂牛奶封閉后，加入抗mTOR磷酸化抗體（1∶1000）、P70S6K（1∶1000）、LC3（1∶1000）、Beclin1（1∶1000），p62 （1∶2000）和β-actin（1∶5000）抗體于4℃孵育過夜。取出膜用TBS-T漂洗3次后，將膜和相應2抗（1∶5000）在搖床上室溫孵育1 h，取出膜后TBS-T漂洗3次后，加入ECL化學發光試劑顯色后，用LI-COR免疫印跡成像系統進行掃描，以ImageJ軟件分析各條條帶積分吸光度值，以β-actin條帶為內參，將目標條帶吸光度數值除以β-actin條帶吸光度數值后得到目標條帶的相對表達量，所有免疫印跡實驗數值均為3次獨立實驗后得到的均值，并表示為平均光密度值±SD值形式用于半定量分析。

1.5統計學分析

應用SPSS19.0統計學軟件進行分析。實驗結果數據為3次獨立實驗均值，計量結果用均數±標準差（x±s）表示，符合正態分布，則組間比較根據數據類型采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用ANOVA方差分析；若不符合正態分布，則采用非參數 Mann-Whitney檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

圖1　IRN誘導SH-SY5Y細胞自噬的發生

表1　不同濃度IRN對自噬相關蛋白相對表達水平的影響（x±s，n=3）

2　結果

2.1異鉤藤堿引起SH-SY5Y細胞自噬相關蛋白表達

LC3-Ⅱ是自噬特異性標志物，其表達水平一定程度上反映細胞自噬體情況。如圖1所示，不同濃度IRN作用SH-SY5Y細胞后可以上調LC3蛋白的表達，并且有劑量依賴性，即隨著IRN濃度增加，表達水平也逐漸上調，對條帶進行量化后，其數值在0、6、12、24 μM組中，LC3-Ⅰ的相對β-actin表達分別為（1.69±0.16）、（1.80±0.27）、（1.57±0.15）、（1.78±0.12），LC3-Ⅱ的表達分別為（0.086±0.02）、（0.39±0.14），（0.96±0.09）、（1.93±0.14）。而p62的表達水平則逐漸下調，其數值在0、6、12、24 μM組中分別為（2.28± 0.21）、（1.50±0.20）、（1.11±0.13）、（0.91±0.15）。提示IRN可以誘導細胞自噬發生。隨后我們通過建立恒定表達GFP-LC3的細胞株，用來觀察IRN處理以后GFPLC3斑點的形成情況，如圖1C所示IRN作用24 h后，可以顯著誘導大量GFP-LC3斑點的形成，GFPLC3熒光斑點數目在對照和IRN不同濃度處理組（6、12、24 μM）中分別為2±1/細胞，4±1/細胞，8±1/細胞，和14±2/細胞，IRN各濃度組與對照組比，差異具有統計學意義（n=3，P＜0.05）。以上結果都證實IRN是可以引起神經元細胞SH-SY5Y自噬發生的誘導物質。

2.2異鉤藤堿對自噬體成熟的影響

為了解IRN對自噬的誘導機制，我們進一步通過加入溶酶體抑制劑CQ來判斷其是否可以影響自噬溶酶體成熟，如圖2所示，通過CQ和IRN處理12 h后，對細胞內蛋白進行WB分析提示，CQ作用后可以顯著的提高LC3的表達，LC3-Ⅰ表達水平從對照組的（0.92±0.0011）上調到（0.68±0.02），LC3-Ⅱ從對照組中的（0.11±0.03）上調到（0.29±0.04）。在CQ加入IRN后可以進一步提高LC3-Ⅰ（0.76±0.03）和LC3-Ⅱ（0.64±0.052）的表達，要顯著高于單用CQ組（0.68± 0.02）的水平（n=3，P＜0.05）。此外我們還分析了GFPLC3的斑點實驗，結果發現IRN組中為14±2/細胞，而用5mM的3MA處理24 h后，可削弱IRN對GFP-LC3斑點的誘導效應，GFP-LC3斑點為3±1/細胞（n=3，P＜0.05）。在單用CQ和CQ+IRN組中，GFP-LC3為21±2/細胞，和30±3/細胞，提示CQ刺激LC3表達，和IRN合用后，效果增強。該進一步證實，IRN是SH-SY5Y細胞的自噬誘導物，并與CQ有協同促進LC3-Ⅱ表達的作用，其誘導的自噬可以被3-MA阻斷。

2.3異鉤藤堿對a-Syn蛋白聚集的影響

為進一步了解IRN對當代聚集的影響，考察對a-Syn蛋白表達的影響。如圖3A所示，隨著IRN濃度的增加，a-Syn的表達水平逐漸下調，并呈現濃度依賴性，在0、6、12、24 μM組中的相對表達量為：（0.71± 0.07），（0.69±0.05），（0.53±0.04），（0.36±0.034）。隨后對我們加入CQ和3-MA，結果顯示3-MA可以上調a-Syn的表達（0.64±0.04），這也就提示，在神經元細胞中，抑制自噬可能會抑制積聚蛋白的降解。而在3-MA+IRN組中，可以上調a-Syn表達（0.63±0.04），提示3-MA對由IRN引起的a-Syn積聚有一定的削弱作用。而在CQ處理組中，a-Syn的表達有一定程度的上調（0.42±0.04），同時加入IRN和CQ后以后對a-Syn的表達并無顯著影響（0.36±0.032，與單用CQ組比，n=3，P＞0.05）。該結果提示3-MA對a-Syn積聚的影響較大，自噬是清理a-Syn的重要途徑，IRN可以減少a-Syn的表達。

圖2　IRN聯合溶酶體穩定劑以及自噬抑制劑后對LC3表達的影響

表2　加入自噬抑制劑后對細胞內GFP-LC3熒光斑點數目的影響

圖3　IRN對a-Syn蛋白表達的影響

表3　IRN加入不同自噬抑制劑后對a-Syn蛋白表達水平的影響

2.4異鉤藤堿誘導自噬的途徑分析

為了進一步闡明IRN作用的分子機制。我們對自噬經典途徑mTOR進行分析，結果如圖4A所示，磷酸化mTOR以及其底物p70s6k都不受IRN的影響，而陽性藥物雷帕霉素加入后可以大幅度抑制mTOR和pP70s6k磷酸化。此外，我們還檢測在IRN處理后，其他的幾個途徑包括AKT、AMPK、MEK/ERK、JNK和ER應激途徑，以及鈣信號途徑等，都未見有顯著改變（數據未展示）。最后我們檢測了Beclin1蛋白，該蛋白是自噬激活中的關鍵因子，上調Beclin1后可以誘導自噬的發生，結果如圖4所示，IRN并不影響Beclin1蛋白的表達，但是用Beclin1特異性是siRNA干擾其表達以后可以顯著抑制由IRN誘導的LC3-Ⅱ的表達，這一結果也提示，Beclin1蛋白在IRN誘導自噬中的作用也是非常關鍵的，提示IRN直接作用的蛋白可能需要Beclin1蛋白的協助形成自噬激活物后發揮作用。

圖4　IRN對mTOR磷酸化以及Beclin1表達的影響

3　討論

細胞自噬過程中，常常伴隨有LC3蛋白的表達，LC3即Light chain3，最初被認為是微管相關蛋白1A 和1B即MAP1LC4，隨后在酵母中發現，和該蛋白高度同源的Atg8/Aut7/Cvt5對于自噬至關重要，在人體中LC3有3種亞型，LC3A、LC3B和LC3C。在自噬開始前以無活性的形式存在，LC3通過羧基端即C端與自噬相關的特異性基因4（Atg4）結合，剪切為LC3-Ⅰ在胞漿內表達，隨后通過泛素化系統與脂酰乙醇胺（PE）發生酯化反應，得到LC3-Ⅱ（LC3-PE），這其中有Atg7和Atg3的參與。LC3-Ⅱ分子可以特異地結合在自噬膜泡的內膜和外膜上，LC3-Ⅱ的含量與自噬泡數量呈正相關，從而可以用于評估自噬活性［7］。因此，其常作為研究細胞自噬的標志分子。本研究結果顯示，不同濃度IRN處理SH-SY5Y細胞24h可濃度依賴性地上調LC3-Ⅱ表達，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高，IRN 6～24 μmol·L-1處理SH-SY5Y細胞24 h后，GFP-LC3熒光斑點標記的自噬體增多，提示自噬體大量形成。這些結果都證明，IRN可能通過激活自噬相關蛋白LC3導致SH-SY5Y細胞發生自噬。目前，有關自噬在神經退行性疾病的發生發展中的作用報道不一［8，9］，在亨廷頓病研究中發現，依賴神經元細胞自噬途徑可加速突變亨廷頓蛋白清除，減少蓄積，同時誘導細胞自噬的發生可減緩神經的退行性變［10，11］。在阿爾茨海默病中的研究發現，神經元細胞中的自噬體富含Aβ和APP羧基末端偏殿，以及早老素依賴性的γ-分泌酶，抑制神經元自噬將有助于減少Aβ40和Aβ42額分泌，而誘導自噬則可以促進前述2種蛋白的分泌。但是從另一種角度，自噬也是清除Aβ的一種途徑，較多的細胞和動物實驗認為，誘導自噬可以減少Aβ的聚集。因此自噬在AD的發病機制中的作用存在爭議［12，13］。在海藻酸鈉誘導大鼠紋狀體神經元興奮性損傷研究中，自噬的激活可促進神經元死亡，并可被自噬抑制劑所削弱。以上研究提示，細胞自噬的發生在神經系統疾病中既有保護作用又可能有損傷作用，和具體的疾病和神經元有關。有研究顯示，IRN可以保護PC12細胞對抗由β-淀粉樣蛋白引起的細胞凋亡［14］，在多項動物實驗中顯示，IRN可以改善由β-淀粉樣蛋白引起的大鼠認知損傷，主要與抑制神經元細胞凋亡和tau蛋白形成有關［15］，IRN可以改善D-半乳糖引起的小鼠學習和記憶損傷［16］，這些研究都從不同角度證實了IRN在神經元保護中的作用和價值，結合本研究得到的結果，我們認為IRN在神經元退行性疾病中可能主要以保護作用為主。

多巴胺能神經元是PD患者大腦中受影響主要細胞，a-Syn在期中樞神經細胞中的過表達可以導致多種生物體多巴胺能神經元的變性。a-Syn降解主要通過蛋白酶體、自噬以及伴侶分子介導的自噬即CMA等途徑，但是僅有2個自噬途徑可以降解a-Syn。具體說，已經有報道，a-Syn可以抑制cma并其只有巨自噬才能降解該蛋白。自噬也被認為可用于對抗突觸核蛋白病的治療策略，本研究中結果提示IRN可以顯著削弱a-Syn的表達，后續研究將進一步考察IRN 對a-Syn突變體以及a-Syn/Synphilin-1聚集體的影響，這些結果在既往針對雷帕霉素、海藻糖以及17-AAG中的研究中未見報道。Beclin1是酵母自噬相關的特異性基因6也就是Atg6在人體中的同源體，主要可表達在高爾基體、線粒體、內質網以及細胞漿內［17］，參與調控自噬前體生成和自噬體的形成。因此，Beclin1表達增強也可作為評價自噬水平升高的重要指標。盡管IRN作用后不影響Beclin1表達，但是siRNA干擾Beclin1后可以顯著削弱IRN誘導的LC3-Ⅱ上調，提示Beclin1參與IRN誘導的自噬，后者可能會影響到自噬體其他相關蛋白表達。本研究組將在后續實驗中進一步明確IRN對Beclin1相關蛋白的影響。以期進一步證實自噬在IRN誘導SH-SY5Y細胞自噬中的作用及與Beclin1的關系。

細胞自噬性死亡的發生受多種因子的調控，主要可以分為mTOR依賴性通路和mTOR非依賴性通路［18］，mTOR作為一個絲蘇氨酸蛋白激酶，能夠感知細胞內ATP、生長因子、胰島素的水平，進而也就是感受細胞內營養和能量的變化，參與組成TORC1和TORC2，并可以受上游多種不同信號通路的影響，比如經典的PI3K、MAPK等通路，影響自噬的發生［19］。mTOR的活化和抑制主要受到TSC1/TSC2的控制。而mTOR非依賴性通路則主要包括RAS-MAPK、Ca-AMPK、p53、PTEN以及內質網應激等［20］。同時我們的研究也提示，IRN通過mTOR非依賴性途徑誘導細胞自噬，并排除了其他幾種mTOR非依賴性通路的可能，但是未對p53以及PTEN等通路進行檢測，后續研究有必要進一步分析其作用的具體蛋白，IRN通過mTOR非依賴性通路發揮作用，也在一定程度上消除了未來臨床應用中與mTOR途徑相關的副作用和并發癥發生的可能性。

本研究結果表明，IRN可誘導SH-SY5Y細胞發生自噬性死亡，溶酶體穩定后可以促進IRN誘導的LC3-Ⅱ表達，自噬抑制劑3-MA作用后則削弱其表達，分子途徑分析認為，IRN誘導的自噬為mTOR非依賴型，對Beclin1蛋白的表達無影響，可能通過活化與Beclin1相關蛋白，與Beclin1結合后活化自噬有關。綜上所述，IRN作為一種可以通過血腦屏障的傳統中藥鉤藤的活性組分，不僅能夠減少異常蛋白的積聚，而且有潛在的保護作用，IRN有進一步研究的價值，并有望將結果應用于臨床。

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Occurrence of autophagy of SH-SY5Y cells induced by isorhynchophylline via independent pathway of mTOR

XU Yan1YAN Wang2CAI Yawei1WANG Jiye3
1.Department of Geriatrics，Ningbo Second Hospital，Ningbo 315010，China；2.Department of Neurology，Ningbo Second Hospital，Ningbo315010，China；3.Zhejiang Police College，Hangzhou 310053，China

R742.5

A

1673-9701（2016）17-0028-07

浙江省醫藥衛生科技計劃基金項目支持（2014 KYA198）
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（2016-03-31）